第一部分STAT3及其相关竞争性内源RNA在肝内胆管癌中的表达与调控机制的初步研究目的:本实验的目的在于通过研究转录信号传导因子及激活子3(Signal Transducer and Activator of Transcription3,STAT3)在肝内胆管癌中的表达情况,明确肿瘤原发灶、近肿瘤肝组织以及淋巴结中STAT3表达及其差异,并从数据库中筛选STAT3相关的竞争性内源RNA(Competing endogenous RNAs,ce RNA),明确ce RNA与STAT3的表达相关性,并进一步验证候选ce RNA在STAT3调控肝内胆管癌过程中的作用。背景:肝内胆管细胞癌(Intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC)的发病率约占肝脏原发性肿瘤的10%至15%,是发病率仅次于肝细胞癌的肝脏原发恶性肿瘤。肝内胆管细胞癌起源于肝脏的二级胆管及其分支上皮,其病理学种类多数为不同分化程度的腺癌,癌细胞浸润性侵袭汇管区血管或神经。因其浸润性生长的特点,ICC形成肝内转移或侵袭肝外淋巴结甚至临近器官的几率大于其他肝脏原发的恶性肿瘤。在实际的临床诊疗过程中,ICC与其他的肝脏原发的恶性肿瘤相比切除率、治愈率更低,并且缺乏有效的辅助治疗方法。截止到目前为止手术切除仍是治愈肝内胆管癌唯一有效的途径,但因肝内胆管癌初期症状不明显且病程发展较快,确诊时有机会接受根治性手术治疗的患者并不占多数。STAT3是一类在各种组织与细胞中广泛表达的癌基因,STAT3通过磷酸化的方式被激酶活化,经过活化后STAT3通过细胞因子以及生长因子将其信号向细胞核内传递,从而达到影响靶基因转录的效果。如促进细胞增殖、细胞生成、促进或抑制微血管生成、细胞粘附等,STAT3是JAK-STAT信号转导通路的组成部分。竞争性内源RNA(ce RNAs)假说:不同种类的RNA之间可以通过位于RNA上的micro RNA的结合位点(MREs)竞争性的结合,这种彼此之间的竞争性的结合实现了ce RNAs之间调控表达的互相影响,因而形成了一种庞大的竞争性内源RNA调控网络。STAT3的表达在近期的多项研究中被证实密切影响着肿瘤的预后,急性髓细胞性白血病、皮肤癌、非小细胞型肺癌等肿瘤的无瘤生存期、5年生存率以及中位生存时间被证实与STAT3的表达相关。而针对上述肿瘤发病机制的研究表明,micro RNA可直接或间接的参与STAT3在肿瘤中的活化调控。根据竞争性内源RNA假说,ce RNA可通过共同的micro RNA结合位点对其竞争性的结合,这就提示我们micro RNA可作为中介将ce RNA与STAT3联系在一起。查阅文献后,我们发现尚未有研究明确ce RNA在肝内胆管癌中调控STAT3的表达,这为我们的研究奠定了理论基础。方法:病理评分区分表达情况:对纳入本实验的组织标本(肿瘤组织、近肿瘤肝组织、淋巴结组织)进行免疫组化染色,并根据免疫组化显色的结果进行评分(阳性细胞着色程度,阳性细胞占所观察同类细胞数的百分比),区分STAT3在肿瘤组织中的高表达与低表达。功能学实验:本研究构建了以pc DNA3.1(-)为载体的STAT3过表达质粒,并将pc DNA3.1-STAT3以及pc DNA3.1空载体导入胆管癌9810细胞系中。通过划痕实验和transwell实验,探究STAT3过表达对9810细胞迁移能力的影响。机制实验:查询ce RNA数据库中筛选STAT3可能的候选ce RNAs(ACSL4、IFNAR2、MAP3K5、MAP3K9、SOD2、TNFRSF10B、XIAP、Lnc RNA-NEAT1),RT-PCR检测8种候选ce RNAs与STAT3表达之间的关系。应用小分子si RNA干扰候选ce RNA,Real-Time PCR和Western-blot检测STAT3的表达情况,初步明确ce RNA对STAT3表达调控作用。结果:免疫组化结果显示,在48例肝内胆管癌患者肿瘤组织内STAT3阳性表达率为85.4%(48例标本中有41例呈阳性表达);而48例近肿瘤肝组织标本中STAT3的阳性表达率为12.5%。纳入本实验的病例中有16例患者发生了淋巴结转移,我们检测转移淋巴结与原发肿瘤灶中STAT3的表达情况,发现其中13例淋巴结STAT3表达水平比原发肿瘤中高,占淋巴转移患者总体的81.5%。胆管癌细胞系中导入STAT3过表达质粒pc DNA-STAT3,划痕实验以及transwell实验表明导入STAT3过表达的9810细胞迁移能力高于导入空载体的9810细胞。PCR结果提示我们:8种候选ce RNA表达水平与STAT3表达水平呈正相关,其中Lnc RNA-NEAT1的表达与STAT3呈显著相关(P<0.001)。根据以上数据提示并经文献查阅后我们以Lnc RNA-NEAT1作为主要研究对象,分别采用干扰Lnc RNA-NEAT1的si NEAT1以及对照si RNA转染RBE细胞,发现实验组相较于对照组Lnc RNA-NEAT1以及STAT3的RNA表达水平均下调。Western-blot结果提示实验组相较于对照组STAT3表达降低。结论:STAT3在肝内胆管癌肿瘤组织中表达高于近肿瘤肝组织;STAT3能够促进肝内胆管癌细胞的转移侵袭能力;候选ce RNAs(Lnc RNA-NEAT1)与肿瘤组织中STAT3的表达水平呈显著正相关(P<0.001);Lnc RNA-NEAT1作为竞争性内源RNA可以调节STAT3的表达。第二部分循环肿瘤细胞在原发性肝细胞癌患者外周血中分离捕获技术及其应用目的:本研究利用循环肿瘤细胞直径大于正常细胞的特征,采用特定孔径薄膜滤过富集的方法分离肝细胞癌患者外周血中的循环肿瘤细胞。排除正常细胞干扰后对循环肿瘤细胞进行计数,结合实验室检查数据、临床资料、病理结果等分析循环肿瘤细胞计数与肝细胞癌肿瘤形成之间的关系。应用显微切割分离已捕获的单个循环肿瘤细胞,并通过单细胞基因组扩增技术扩增循环肿瘤细胞基因组,为肝细胞癌患者循环肿瘤细胞高通量测序做前期的准备工作。背景:循环肿瘤细胞(Circu Lating tumor cell,CTC)概念的首次提出距今已有一百四十余年的历史,CTC是指进入外周血中的恶性肿瘤细胞。最近十年来因为富集、分离、鉴别手段的丰富,CTC才得到较为系统的研究。文献报道证实,CTC在肿瘤的转移及复发中扮演着重要的角色。应用CTC作为标志物检测早期患者以及监测化疗药物的耐药性已经在乳腺癌、肺癌、前列腺癌、结肠癌的临床诊疗中得到部分应用。循环肿瘤细胞微栓子(Circulating tumor microemboli,CTM)是由三个或三个以上CTC聚集而成的癌细胞栓子,CTM的出现已被近期研究证实与胰腺癌、前列腺癌等肿瘤晚期远处转移密切相关。原发性肝细胞癌(HCC)的发病人群常见于HBV感染史、饮酒史的中年男性或绝经期后女性,因其生长速度快、早期无明显症状导致手术根治性切除率低预后差。据统计2012年我国原发性肝细胞癌的发病率占全球发病率的52.7%为世界第一,我国东部沿海地区HCC发病率高于西部内陆省份,男性发病率显著高于女性(平均4.15:1)。在全球范围内虽然通过推广新生儿乙肝疫苗的注射以及针对乙肝病毒携带者腹部超声检查降低了HCC的发生率并且提高了肿瘤的早期检出率,但因各种客观条件制约以及HCC本身的生物学特性导致其病死率依然居高不下。CTC因其本身在肿瘤转移和复发中扮演的重要角色,被应用在监测HCC转移及复发的机制研究上。而CTC所携带的基因组与肿瘤组织基因组的同源性,可被应用于化疗药物耐药性的监测。我们的研究尝试从肝癌患者外周血中分离捕获CTC并扩增其携带的基因组,从而达到体液活检的目的。方法:实验对象为经东方肝胆外科医院确诊的原发性肝细胞癌患者,在取得知情同意后,取患者外周血6ml。应用友芝友公司生产YZY-CTC-BIOPSY异常细胞分离染色仪截留细胞,通过肿瘤细胞形态学与正常细胞的区别鉴别CTC,并应用免疫荧光染色的方法对CTC进一步确认(有效排除正常细胞干扰)。对确认后的CTC进行计数,统计患者术后病理学资料、实验室检查结果、临床检测指标,分析计数与疾病及其病理数据之间的关系。显微激光切割的方法将CTC分离,利用单细胞基因组扩增技术扩增CTC基因组,用于高通量测序或肿瘤病人耐药性检测等个体化精准医疗的开展。结果:本研究应用CTC-BIOPSY异常细胞分离染色仪可以有效的将循环肿瘤细胞(CTC)以及循环肿瘤细胞微栓子(CTM)截留在筛孔滤膜上;免疫荧光染色鉴别可以有效的排除WBC对CTC计数的影响;显微激光切割平台可以捕获薄膜截留的CTC细胞,并在收集时将CTC与正常细胞加以区分;统计纳入研究的患者实验室检查资料、病理资料检验分析后发现包膜完整、血管侵犯与CTC在外周血中的出现有关(P<0.05);对薄膜截留并经激光切割的CTC基因组扩增后,其携带的基因组可以被有效的放大。