【摘 要】
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牛蒡是一种具有丰富的营养及药用价值的传统药食同源植物。我国江苏徐州丰县是牛蒡的主要种植地之一,有“牛蒡之乡”的美誉。牛蒡多出口于日本、韩国等地,是日本餐桌上常见的美食,而国内对牛蒡的认知相对较少。造成这一现象的原因可能是对于牛蒡的物质组成、营养价值和生理活性的认识相对较浅,没有正确而全面的了解。牛蒡富含膳食纤维,多糖作为牛蒡中重要的生物活性物质之一,具有抗炎及抗氧化等多种生物活性,近年来备受关注。
【基金项目】
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江苏省农业自主创新基金项目（CX（19）2006）；
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牛蒡是一种具有丰富的营养及药用价值的传统药食同源植物。我国江苏徐州丰县是牛蒡的主要种植地之一,有“牛蒡之乡”的美誉。牛蒡多出口于日本、韩国等地,是日本餐桌上常见的美食,而国内对牛蒡的认知相对较少。造成这一现象的原因可能是对于牛蒡的物质组成、营养价值和生理活性的认识相对较浅,没有正确而全面的了解。牛蒡富含膳食纤维,多糖作为牛蒡中重要的生物活性物质之一,具有抗炎及抗氧化等多种生物活性,近年来备受关注。本文以牛蒡根为原料,从中提取多糖,并对多糖的生物活性进行研究。主要研究内容及结果如下:（1）本研究采用Box-Behnken响应面设计,优化热水提取牛蒡多糖（Arctium lappa L.polysaccharides,ALP）的工艺条件,并考察其抗氧化能力。分析了液固比（10:1～30:1）、提取温度（60～100℃）和提取时间（1～3 h）对ALP得率的影响。数据拟合为多项式响应模型和多元回归分析,具有较高的决定系数（R~2=0.9754）。结果表明,料液比与提取时间对多糖得率的影响较显著。在液料比16.20:1、71.12℃提取2.51 h的最佳工艺条件下,拟合预测提取多糖得率最高为9.73%,为方便实际操作,本研究选择以液料比16.2:1、71℃提取2.5 h进行最佳工艺验证,此条件下ALP得率为10.11±0.38%。此外,优化后的ALP对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼、2,2’-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸的清除能力和氧自由基吸收能力分别为232.23±4.19、407.84±1.48和2932.54±145.29μmol Trolox/g。说明ALP具有潜在的抗氧化能力。（2）本研究选用脂多糖去刺激RAW264.7细胞来构建巨噬细胞免疫模型,探究了ALP的免疫调节作用。首先用细胞计数试剂法检测了ALP及脂多糖对RAW264.7细胞的毒性作用,确定ALP及脂多糖的加药浓度。通过中性红实验检测了RAW264.7细胞的吞噬活性。结果表明ALP可以增强小鼠巨噬细胞的吞噬能力。同时发现ALP还可以减少核因子E2相关因子2的信使核糖核酸（messenger RNA,m RNA）表达。通过Griess试剂检测了ALP对RAW264.7细胞分泌一氧化氮的影响,并采用实时荧光定量聚合酶链反应技术检测了诱导型一氧化氮合酶的m RNA的相对表达,ALP能抑制脂多糖诱导的RAW264.7细胞一氧化氮水平的升高,说明ALP有一定的免疫调节和抗炎活性。通过酶联免疫吸附实验、实时荧光定量聚合酶链反应、蛋白免疫印迹等技术探究ALP发挥免疫调节活性的可能信号通路,发现ALP能够下调脂多糖诱导的RAW264.7细胞中促炎细胞因子（白介素-1β、白介素-6、白介素-8、肿瘤坏死因子-α）转录水平及蛋白相对表达水平;作用机制是通过抑制Toll样受体4/核因子-kappa B信号通路的关键位点（白细胞分化抗原14、Toll样受体4、髓样分化蛋白2、肿瘤坏死因子受体相关因子6、髓样分化因子88、核因子-kappa B）达到免疫调节和抗炎作用。（3）本研究采用白细胞介素-1β刺激Caco-2细胞构建肠道细胞炎症模型,探究ALP对肠道炎症的抑制作用。利用细胞计数试剂法检测了ALP及白细胞介素-1β对Caco-2细胞的毒性作用,确定ALP及白细胞介素-1β的加药浓度。与巨噬细胞中结果类似,ALP也能减少核因子E2相关因子2的m RNA表达,通过减缓氧化应激保护肠道。通过酶联免疫吸附实验、实时荧光定量聚合酶链反应、蛋白免疫印迹、免疫荧光等技术研究ALP是否也是通过对Toll样受体4/核因子-kappa B信号通路发挥肠道炎症的抑制作用,结果表明,ALP能抑制白细胞介素-1β诱导的Caco-2细胞中炎症因子（单核细胞趋化蛋白-1、细胞间黏附分子-1、血管细胞黏附分子-1）转录水平及蛋白相对表达水平,作用机制也是通过下调Toll样受体4/核因子-kappa B信号通路关键位点（Toll样受体4、髓样分化蛋白2、肿瘤坏死因子受体相关因子6、髓样分化因子88、核因子-kappa B）转录水平及蛋白水平达到抑制肠道细胞炎症作用。以上研究结果表明,ALP对巨噬细胞和肠道细胞有显著的免疫调节和抑制炎症效果,抗炎与抗氧化存在一定的内在联系,这些结果为以后牛蒡多糖作为功能性食品配料应用于免疫调节抑制炎症奠定了基础。
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