目的通过软骨细胞海藻酸钙支架共培养,观察软骨细胞在支架材料上的生物行为。将支架植入兔膝关节软骨缺损模型,定期膝关节局部注射10ng/ml的瘦素,观察、缺损处的修复状况,进而探讨瘦素对兔膝关节软骨损伤是否具有一定的修复作用。方法1.软骨细胞分离与培养:2只健康4周龄新西兰兔膝关节软骨,将软骨细胞分离及扩增、传代。光镜下软骨细胞呈星形、多角形,铺路石样生长,HE染色观察软骨细胞形态,免疫组化染色观察Ⅱ型胶原分泌情况。2.海藻酸钠与氯化钙混合后得到的三维支架,将传代的软骨细胞培养于其中。显微镜下观察细胞生长增殖状况,并做HE染色及免疫组化染色。3.用成年新西兰大白兔制备兔膝关节缺损模型。4.将实验动物随机分为3组:对照组:每5日经兔膝关节腔内注射1ml生理氯化钠;支架组:经兔膝关节缺损腔内植入修整好的含有软骨细胞的三维支架,并每5日注射生理氯化钠1ml;实验组:三维支架植入后,每5日局部注射1ml的10ng/ml瘦素。实验中注意随机分组,实验个体缺损部位相同,分别于术后12周处死取材,观察缺损区软骨生长修复情况,并用HE染色、Masson染色、免疫组化染色及PCR定量分析检验修复情况。以评价瘦素对三维支架植入对软骨缺损的修复作用。结果1.分离下来的软骨细胞呈圆形或椭圆形,经24小时后逐渐贴壁,72小时后大部分已经贴壁。2.传代后的软骨细胞HE染色镜下观察呈三角形、多角形或梭形,细胞核明显,呈圆形或椭圆形,HE染色显示软骨细胞形态良好。免疫组化染色观察结果见细胞及基质呈棕黄色,细胞密集处颜色较深,表现出其特有活性。3.将混悬的软骨细胞、海藻酸钠、氯化钙混合,制备出了三维支架,支架内培养的细胞未见明显的凋亡与裂解,且细胞活性良好,HE及免疫组化检查结果说明三维培养的细胞适合植入。4.植入关节腔内后,未见明显炎症反应及免疫排斥反应,支架软硬适宜,不会损伤关节软骨,且后期材料降解完全,无关节残留,表现出良好的组织相容性。5.植入修整后的三维支架并每日注射瘦素,促进了Ⅱ型胶原及IGF-1的生成,对缺损处的修复有明显促进作用。6.实验组:膝关节缺损处表面平整较光滑,与其他两组相比,PCR扩增实验检测IGF-1分泌明显高于其他两组,差异具有统计学意义;对照组:缺损处未见明显修复,膝关节粘连、关节软骨破坏较重,可见明显骨性关节炎表现;支架组:缺损处软骨较光滑,但低于实验组,膝关节未见骨性关节炎表现。7.组织病理学检查显示,实验组纤维及瘢痕组织较少,Ⅱ型胶原染色显示数量高于其他两组,HE染色显示少量成纤维细胞,核较小,排列相对规则。对照组纤维组织多,排列紊乱,软骨细胞少,核大,排列不规律。支架组软骨细胞细胞核、成纤维细胞数量及结构介于两者之间。结论1.藻酸钙支架与软骨细胞共培养,软骨细胞可以很好的在支架材料的表面和内部黏附、生长及增殖,细胞活性良好,未见明显细胞毒性。2.实验过程中藻酸钙支架材料在兔体内引起的炎症反应轻微,血管化良好,材料降解吸收缓慢,具有良好的组织相容性。3.本实验条件下10ng/ml的瘦素,可促进软骨细胞增殖、Ⅱ型胶原及IGF-1的分泌,局部定期注射可促进兔膝关节软骨损伤的修复。