研究背景与目的:　　中枢神经系统缺血缺氧性损伤是常见的临床疑难问题，缺血性脑病是最常见的脑血管病，已成为威胁人类健康的主要三大疾病之一，目前仍无较好的干预措施及治疗药物。脑血管损伤或病变常引起脑血流灌注不足致脑组织氧供不足，全脑缺血常见于心脏骤停，麻醉手术期间的严重低血压及严重休克等。脑组织高氧耗及低氧储备的特点使其对缺血缺氧极为敏感，在缺血后的数分钟内即发生能量代谢障碍、氧自由基损伤、钙超载、谷氨酸兴奋性毒性及细胞凋亡等一系列变化。阐明缺血性脑病发生发展的病理生理机制，寻求切实有效的干预措施来减轻或阻止缺血再灌注后脑组织损伤，已成为防治缺血性脑病亟待解决的问题。　　细胞周期末期促进复合物（Anaphase Promoting Complex，APC），又称循环体（cyclosome），是真核细胞内泛素蛋白酶小体系统（Ubiquitin Proteasome System，UPS）的主要成分之一，Cdh1（Cdc20homologue protein1）是其调节亚基。Gieffers等发现，在中枢神经系统中APC/C-Cdh1主要表达于终末期分化神经元中，提示其参与CNS功能与稳态的调节。大量研究证实，APC/C-Cdh1在细胞分化、轴突生长及神经退行性疾病中发挥重要作用。新近研究表明，APC/C-Cdh1在阿尔兹海默症（Alzheimer’s Disease,AD）等神经退行性疾病的发生发展中发挥重要作用。我们前期研究发现，在短暂性全脑缺血再灌注后第3天，大鼠海马组织Cdh1表达量下降，体外原代培养的大鼠皮层星形胶质细胞氧糖剥夺/再复氧（Oxygen Glucose Deprivation/Reoxygenation，OGD/R）72小时后，Cdh1的表达量下降，同时伴随着糖酵解的激活。利用重组Cdh1慢病毒上调原代星形胶质细胞的Cdh1表达水平可有效逆转OGD/R引起的Cdh1表达下调和糖酵解的激活。这些前期研究提示，Cdh1的下调参与大鼠全脑缺血再灌注损伤及体外星形胶质细胞OGD/R后反应性活化与增殖，为进一步明确Cdh1在缺血性脑损伤病理生理过程中的作用，探求以Cdh1为靶点的脑保护策略，我们利用重组Cdh1慢病毒上调大鼠海马Cdh1的表达，观察对tGCI/R术后大鼠神经元凋亡、胶质细胞活化与增殖、氧化应激损伤、突触超微结构、焦虑抑郁及空间学习记忆功能的影响。　　研究方法与结果:　　1.重组Cdh1慢病毒成功感染体外293T细胞并表达于大鼠海马组织　　方法：利用慢病毒基因重组技术合成构建Cdh1过表达慢病毒载体，浓缩纯化后体外感染HEK293T细胞，72h后荧光显微镜下观察细胞GFP蛋白自发荧光信号。选择健康雄性SD大鼠，随机分为3组：Na?ve组、空病毒组和重组Cdh1慢病毒组。Na?ve组不做任何干预处理，其他两组利用脑立体定位注射技术分别向大鼠海马CA1区注射对照空病毒LV-GFP和重组Cdh1慢病毒LV-Cdh1-GFP，病毒在体感染72小时后断头取脑组织冰冻切片检测海马CA1区GFP的表达。确定重组Cdh1慢病毒在海马组织成功表达后，采用Pulsinelli四血管结扎法（4-VO）构建短暂性全脑缺血再灌注（tGCI/R）模型，随机分为四组：假手术组（Sham）、生理盐水对照组（IR+Saline）、空病毒组（IR+Lenti-GFP）和重组Cdh1慢病毒组（IR+Lenti-Cdh1-GFP）。全脑缺血再灌注后第3天利用分子生物学方法检测重组慢病毒对海马组织Cdh1及其底物表达的影响。　　结果：重组Cdh1慢病毒感染HEK293T细胞72小时后，荧光显微镜下可见大量293T细胞有GFP自发荧光信号。大鼠海马病毒立体定位注射72小时后，荧光显微镜下空病毒组和重组Cdh1慢病毒组可见海马CA1区有GFP自发荧光信号。高倍镜下可见空病毒组GFP蛋白的自发荧光信号主要定位于细胞浆，而重组Cdh1慢病毒组的GFP蛋白自发荧光信号主要与细胞核共定位。tGCI/R术后第3天，RT-PCR结果显示，与假手术组大鼠相比，生理盐水对照组和空病毒组大鼠海马CA1区Cdh1mRNA含量明显下降，而重组Cdh1慢病毒组大鼠海马CA1区Cdh1mRNA含量显著高于生理盐水对照组和空病毒组。Western-Blot结果显示，tGCI/R术后第3天海马组织Cdh1蛋白的表达变化与mRNA含量变化趋势一致。生理盐水对照组和空病毒组海马组织Cdh1下游底物蛋白Skp2和SnoN的含量显著高于假手术组，而重组Cdh1慢病毒组Skp2和SnoN的含量明显少于生理盐水对照组和空病毒组。　　2.重组Cdh1慢病毒对全脑缺血再灌注术后大鼠行为学的影响　　方法：选择健康雄性SD大鼠，随机分为4组：假手术组（Sham）、生理盐水对照组（IR+Saline）、空病毒组（IR+Lenti-GFP）和重组Cdh1慢病毒组（IR+Lenti-Cdh1-GFP）。海马立体定位注射慢病毒后第3天采用Pulsinelli四血管结扎法（4-VO）构建短暂性全脑缺血再灌注（tGCI/R）模型，tGCI/R术前至术后一周内观察记录实验大鼠的生存状态并用改良的神经功能评分系统评估大鼠的神经功能缺损情况，同时利用糖水偏爱试验（SPT）测定tGCI/R手术前后大鼠糖水偏爱指数的变化情况。tGCI/R术后第8天利用新物体识别试验（NORT）评估大鼠的短期学习记忆能力，tGCI/R术后第10天利用旷场试验（OFT）评估大鼠的焦虑情绪及运动功能，tGCI/R术后第12天利用高架十字迷宫（EPM）评估大鼠的焦虑情绪，tGCI/R术后第14天利用新奇抑制摄食试验（NSFT）评估大鼠的抑郁表现，tGCI/R术后第8～12天采用Morris水迷宫检测大鼠的空间学习记忆能力。另外，tGCI/R术后第7～13天测定记录实验大鼠每天的摄食量，实验期间每天定时称量并记录大鼠的体重。　　结果：tGCI/R术后1周内神经功能评分明显下降，糖水偏爱指数下降，而重组Cdh1慢病毒可明显改善tGCI/R引起的神经功能缺损，提高糖水偏爱指数，同时可降低tGCI/R术后大鼠的死亡率。在OFT和EPM试验中，生理盐水对照组和空病毒组大鼠表现出明显的焦虑，而重组Cdh1慢病毒可明显改善tGCI/R术后大鼠的焦虑情绪。在NORT和Morris水迷宫试验中，生理盐水对照组和空病毒组大鼠短期学习记忆能力和长期的空间定位学习记忆能力明显受损，而重组Cdh1慢病毒可明显改善tGCI/R引起的短期和长期学习记忆能力受损。在NSFT中，生理盐水对照组和空病毒组大鼠明显表现出抑郁，而Cdh1过表达可部分逆转缺血引起的抑郁表现。　　3.Cdh1过表达减轻全脑缺血再灌注损伤的机制　　方法：选择健康雄性SD大鼠，随机分为4组：假手术组（Sham）、生理盐水对照组（IR+Saline）、空病毒组（IR+Lenti-GFP）和重组Cdh1慢病毒组（IR+Lenti-Cdh1-GFP）。海马立体定位注射慢病毒后第3天采用Pulsinelli四血管结扎法（4-VO）构建tGCI/R模型，tGCI/R术后第3天分别取新鲜海马组织和完整脑组织，利用RT-PCR和Western Blot检测海马组织Cdh1及其下游底物Cyclin B1、凋亡相关蛋白的表达变化；利用冰冻切片免疫荧光染色检测神经元核抗原NeuN表达改变及胶质细胞活化与增殖情况。利用生化试剂盒检测海马组织SOD、CAT、GSH和MDA活性/含量的变化以评估tGCI/R术后氧化应激反应情况。行为学试验结束后取大鼠海马组织或完整脑组织，利用透射电镜（TEM）观察海马CA1区神经元、突触及髓鞘的超微结构，采用尼氏染色和原位末端转移酶标记技术（TUNEL）观察检测tGCI/R术后神经元数目及形态、神经元凋亡变化情况。　　结果：尼氏染色结果显示，与假手术组相比，tGCI/R术后生理盐水对照组和空病毒组大鼠CA1区神经元数量明显减少，同时可见大量异形神经元（核固缩、碎裂）。重组Cdh1慢病毒组CA1区神经元数量减少有所逆转，且异形神经元数量明显减少。NeuN免疫荧光染色和Western Blot结果与尼氏染色结果一致。TUNEL结果表明在生理盐水对照组和空病毒组大鼠CA1区可见大量棕黄色TUNEL阳性神经元，而重组Cdh1慢病毒组TUNEL阳性神经元数目明显减少。GFAP和Iba-1免疫荧光染色显示假手术组海马CA1区胶质细胞胞体较小，突起细长，生理盐水对照组和空病毒组CA1区胶质细胞数目明显增多，且胞体变大，突起变得短而粗，表现出明显的活化与增殖。重组Cdh1慢病毒组大鼠胶质细胞活化与反应性增殖的情况被部分抑制。　　透射电镜结果显示，假手术组海马CA1区神经元形态完整（双层核膜完整，核仁大而圆，核内异染色质均匀分布），核周隙可见大量结构与形态正常的细胞器。突触结构完整，突触前可见大量突触囊泡，突触后致密物均与分布，线粒体多且结构完整。髓鞘结构完整而且厚度均一；生理盐水对照组和空病毒组CA1区神经元形态明显破坏（核仁破裂，核膜不完整，核内异染色质减少并出现边集），核周隙细胞器结构严重受损。突触结构严重受损，突触间隙模糊几乎不可辨认，突触囊泡数目减少，突触后致密物增多聚集，线粒体结构受损。髓鞘结构不完整，可见明显的脱髓鞘及空泡形成，髓鞘厚度变薄且不均一；重组Cdh1慢病毒组神经元、突触及髓鞘的损伤情况有所缓解。　　生化结果显示，与假手术组大鼠相比，生理盐水对照组和空病毒组大鼠tGCI/R术后第3天海马组织抗氧化酶SOD和CAT活性明显下降，抗氧化物GSH含量明显减少，而脂质过氧化产物MDA含量明显升高。重组Cdh1慢病毒大鼠SOD和CAT活性下降、GSH含量减少及MDA聚集情况有所改善。　　PCR及Western结果显示与假手术组大鼠相比，生理盐水对照组和空病毒组大鼠tGCI/R术后第3天海马组织Cdh1和Cyclin B1mRNA水平明显下降，凋亡相关蛋白Bax和cleaved-Caspase3含量明显增加，而抗凋亡蛋白Bcl-2相对含量降低。重组Cdh1慢病毒大鼠Cdh1、Cyclin B1及凋亡相关蛋白改变情况被部分逆转。　　4.统计学处理　　统计学分析采用5.0版GraphPad Prism软件，所有数据以均数±标准误（?(x-)±SEM）表示。生存分析采用Kaplan-Meier生存曲线法，并进行log-rank检验。神经功能评分数据采用Kruskal–Wallis法分析并进行Bonferroni校正的Mann–Whitney U检验。水迷宫数据采用重复测量的双因素方差分析（RM-Two Way ANOVA）或单因素方差分析（One way ANOVA）进行分析，其他数据采用单因素方差分析进行分析，必要时进行Bonferroni或Dunnetts检验，P＜0.05为差异有统计学意义。　　研究总结:　　1.主要研究结果　　a)利用重组慢病毒立体定位注射技术成功上调全脑缺血再灌注后大鼠海马CA1区Cdh1的表达；　　b)慢病毒介导的海马Cdh1过表达可改善缺血引起的大鼠学习记忆功能下降，缓解缺血再灌注术后大鼠的焦虑抑郁表现；　　c)Cdh1过表达可抑制脑缺血再灌注后细胞周期调节蛋白Cyclin B1的异常聚集，抑制氧化应激反应，减少细胞凋亡；　　d)Cdh1过表达可抑制脑缺血再灌注引起的胶质细胞活化与反应性增殖，调节突触超微结构，减轻脑损伤程度。　　2.研究结论　　慢病毒介导的Cdh1过表达可抑制大鼠全脑缺血再灌注后Cyclin B1的异常聚集，阻止神经元异常进入细胞周期从而抑制神经元凋亡。同时，Cdh1过表达可抑制胶质细胞的过度活化与反应性增殖，减轻氧化应激反应，调节突触的超微结构变化从而减轻全脑缺血再灌注损伤。同时Cdh1过表达可缓解脑缺血再灌注引起的焦虑抑郁等负性情绪，改善空间学习记忆等认知功能。　　3.创新之处　　本研究首次证实重组Cdh1慢病毒可成功表达于大鼠海马组织并有效逆转脑缺血再灌注引起的Cdh1表达下调。利用分子生物学、超微病理学和行为学方法揭示了慢病毒介导的Cdh1过表达的脑保护作用机制，对缺血性脑损伤的预防和治疗提供了新的靶点和策略。　　4.展望　　脑缺血再灌注损伤的病理生理机制复杂多样，系统全面的揭示其机制对缺血性脑损伤的防治具有重要的临床意义。本实验论证了Cdh1在脑缺血再灌注损伤过程中的关键作用，对缺血性脑损伤的药物研发及治疗策略提供了新的重要靶点，但Cdh1只是脑缺血再灌注损伤过程中的一个分子，慢病毒载体转基因技术成功调控其表达和功能也只是部分逆转脑缺血再灌注引起的病理生理和行为学变化，Cdh1参与调控的生物学过程复杂多样，以其为靶点探究缺血性脑损伤防治策略的有效性和安全性有待进一步深入研究探讨。