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有机磷酸酯（organophosphate esters,OPEs）主要用作塑料、聚氨酯泡沫、纺织品、热固性涂料和聚合物中阻燃剂和添加剂,OPEs已经被列为高产量化学品。OPEs在环境和组织样品中的广泛存在引起人们对人类健康和环境安全的关注。暴露于OPEs可能存在神经毒性、生殖毒性和内分泌干扰等潜在健康风险。研究表明,OPEs对斑马鱼和大型溞具有生殖毒性效应,但对OPEs生殖毒性进行系统性研究的资料有限。秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans,C.elegans）是研究环境污染物毒性的良好模式生物,在生殖毒性研究方面有优势。利用C.elegans已揭示多种环境污染物诱导的生殖毒性机制,如氧化应激、凋亡和DNA损伤通路等,为进一步研究环境污染物的生殖毒性及其潜在机制提供重要的理论依据。目前关于OPEs的毒性研究多数集中在高剂量暴露,往往难以反映OPEs环境相关浓度暴露后的毒性效应。研究目的本研究以C.elegans为模式生物,研究OPEs（0.1、1、10、100、1000μg/L）亚急性暴露（72 h）对C.elegans的生殖毒性以及潜在机制。研究方法1、OPEs对秀丽隐杆线虫生殖和发育的毒性效应（1）5种OPEs对秀丽隐杆线虫生殖能力和生殖腺发育的影响L1期野生型秀丽隐杆线虫N2亚急性暴露（72 h）于0.1、1、10、100、1000μg/L的磷酸三正丁酯（Tributyl phosphate,Tn BP）、磷酸三甲苯酯（Tricresyl phosphate,TCP）、磷酸三（2-丁氧基乙基）酯（Tris（2-butoxyethyl）phosphate,TBEP）、磷酸三（2,3-二溴丙基）酯（Tris（2,3-dibromopropyl）phosphate,TDBPP）和磷酸三（1,3-二氯异丙基）酯（Tris（1,3-dichloro-2-propyl）phosphate,TDCPP）,检测N2线虫的后代数目、子宫内受精卵的数量、总生殖细胞数和生殖腺臂相对面积,评价5种OPEs暴露对线虫生殖能力和生殖腺发育的影响。针对明显诱导线虫生殖毒性效应的OPEs,进一步研究其生殖毒性的潜在机制。（2）5种OPEs对秀丽隐杆线虫生长发育的影响将L1期野生型秀丽隐杆线虫N2亚急性暴露（72 h）于0.1、1、10、100、1000μg/L的Tn BP、TCP、TBEP、TDBPP和TDCPP,对N2线虫的体长和体宽进行测量,评价5种OPEs暴露对秀丽隐杆线虫生长发育的影响。2、Tn BP和TCP对秀丽隐杆线虫生殖毒性的机制研究（1）Tn BP和TCP对秀丽隐杆线虫氧化应激的影响将L1期野生型秀丽隐杆线虫N2亚急性暴露（72 h）于0.1、1、10、100、1000μg/L的Tn BP和TCP,利用荧光显微镜拍照对N2线虫体内活性氧（ROS）水平进行相对荧光强度分析;检测N2线虫体内SOD抗氧化酶的活力;利用q RT-PCR检测N2线虫线粒体活性氧代谢基因（mev-1和gas-1）的表达,研究Tn BP和TCP暴露对秀丽隐杆线虫氧化应激的影响。（2）Tn BP和TCP对秀丽隐杆线虫生殖细胞DNA损伤的影响将L1期的WS1433/[HUS-1::GFP]转基因线虫和野生型秀丽隐杆线虫N2亚急性暴露（72 h）于0.1、1、10、100、1000μg/L的Tn BP和TCP,利用WS1433/[HUS-1::GFP]转基因线虫检测生殖细胞DNA损伤,利用q RT-PCR检测N2线虫的生殖细胞DNA损伤相关基因（hus-1、clk-2、cep-1和egl-1）的表达,研究Tn BP和TCP暴露对秀丽隐杆线虫生殖细胞DNA损伤的影响。（3）Tn BP和TCP对秀丽隐杆线虫生殖细胞凋亡的影响将L1期的野生型秀丽隐杆线虫N2亚急性暴露（72 h）于0.1、1、10、100、1000μg/L的Tn BP和TCP,利用吖啶橙（AO）活体染色检测N2线虫生殖细胞凋亡,利用q RT-PCR检测N2线虫的生殖细胞抗凋亡基因（ced-9）和促凋亡基因（ced-4和ced-3）的表达,研究Tn BP和TCP暴露对秀丽隐杆线虫生殖细胞凋亡的影响。（4）Tn BP和TCP对秀丽隐杆线虫内分泌干扰的影响将L1期的野生型秀丽隐杆线虫N2亚急性暴露（72 h）于0.1、1、10、100、1000μg/L的Tn BP和TCP,利用q RT-PCR检测N2线虫的卵黄原蛋白相关基因（vit-2和vit-6）的表达,研究Tn BP和TCP暴露对秀丽隐杆线虫内分泌干扰的影响。研究结果1、OPEs对秀丽隐杆线虫生殖和发育的毒性效应（1）5种OPEs对秀丽隐杆线虫生殖能力和生殖腺发育的影响Tn BP（100-1000 ug/L）和TCP（100-1000 ug/L）暴露后,N2线虫的后代数目、子宫内受精卵数目、总生殖细胞数和生殖腺臂相对面积显著降低（P＜0.05）。TBEP、TDBPP和TDCPP暴露后,N2线虫的后代数目、子宫内受精卵数目、总生殖细胞数和生殖腺臂相对面积未发生明显改变（P＞0.05）。以上结果表明,Tn BP和TCP导致线虫的生殖能力降低和生殖腺发育受损,从而产生生殖毒性。（2）5种OPEs对秀丽隐杆线虫生长发育的影响TCP（100-1000 ug/L）和TBEP（100-1000 ug/L）暴露后,N2线虫的体长和体宽显著减小（P＜0.05）。TDBPP（1-1000 ug/L）暴露后,N2线虫的体长显著增大（P＜0.05）;TDBPP（0.1-1000 ug/L）暴露后,N2线虫的体宽显著增大（P＜0.05）。Tn BP和TDCPP暴露后,各剂量组N2线虫的体长和体宽均未发生明显改变（P＞0.05）。以上结果表明,TCP、TBEP和TDBPP导致线虫的体长和体宽受到影响,从而产生发育毒性。2、Tn BP和TCP对秀丽隐杆线虫生殖毒性的机制研究（1）Tn BP和TCP对秀丽隐杆线虫氧化应激的影响Tn BP暴露后,1、10、100和1000 ug/L浓度组N2线虫ROS水平显著增加（P＜0.05）;1000 ug/L浓度组N2线虫SOD抗氧化酶活力显著降低（P＜0.05）;0.1、1、10、100和1000 ug/L浓度组N2线虫mev-1和gas-1基因表达显著降低（P＜0.05）。TCP暴露后,10、100和1000 ug/L浓度组N2线虫ROS水平显著增加、SOD抗氧化酶活力显著降低（P＜0.05）;10、100和1000 ug/L浓度组N2线虫mev-1和gas-1基因表达显著降低（P＜0.05）。以上结果表明,Tn BP和TCP导致ROS水平升高和SOD抗氧化酶活力降低,抑制线粒体活性氧代谢基因（mev-1和gas-1）活性来抑制氧化磷酸化和ROS分解,从而诱导氧化应激并调节线虫生殖毒性的形成。（2）Tn BP和TCP对秀丽隐杆线虫生殖细胞DNA损伤的影响Tn BP（100-1000 ug/L）和TCP（100-1000 ug/L）暴露后,WS1433/[HUS-1::GFP]线虫生殖细胞DNA损伤数目显著上升（P＜0.05）。Tn BP暴露后,1、10、100和1000 ug/L浓度组N2线虫hus-1、clk-2和cep-1基因表达显著增加（P＜0.05）;10和100 ug/L浓度组N2线虫egl-1基因表达显著增加（P＜0.05）。TCP暴露后,0.1、1、10、100和1000 ug/L浓度组N2线虫hus-1基因表达显著增加（P＜0.05）;100和1000μg/L浓度组N2线虫clk-2和egl-1基因表达显著增加（P＜0.05）;1、10和100μg/L浓度组N2线虫cep-1基因表达显著增加（P＜0.05）。以上结果表明,Tn BP和TCP激活DNA损伤HUS-1/CLK-2-CEP-1-EGL-1信号级联反应,激活hus-1、clk-2、cep-1和egl-1基因的相互作用来诱导线虫生殖细胞DNA损伤,是其生殖毒性机制之一。（3）Tn BP和TCP对秀丽隐杆线虫生殖细胞凋亡的影响Tn BP（100-1000 ug/L）和TCP（100-1000 ug/L）暴露后,N2线虫生殖细胞凋亡数目显著上升（P＜0.05）。Tn BP暴露后,1000 ug/L浓度组N2线虫ced-9基因表达显著降低（P＜0.05）;0.1、1、10和100 ug/L浓度组N2线虫ced-4和ced-3基因表达显著增加（P＜0.05）。以上结果表明,Tn BP影响细胞凋亡CED-9-CED-4-CED-3信号级联反应,抑制抗凋亡基因（ced-9）功能以及激活促凋亡基因（ced-4和ced-3）相互作用诱导线虫生殖细胞凋亡,是其生殖毒性机制之一。TCP暴露后,0.1、1、10、100和1000 ug/L浓度组N2线虫ced-9基因表达显著降低（P＜0.05）;100和1000μg/L浓度组N2线虫ced-4基因表达显著增加（P＜0.05）;然而,0.1、1、10、100和1000 ug/L浓度组N2线虫ced-3基因表达未发生明显改变（P＞0.05）。以上结果表明,TCP影响细胞凋亡CED-9-CED-4信号级联反应,抑制抗凋亡基因（ced-9）功能以及激活促凋亡基因（ced-4）活性诱导线虫生殖细胞凋亡,是其生殖毒性机制之一。（4）Tn BP和TCP对秀丽隐杆线虫内分泌干扰的影响Tn BP和TCP暴露后,0.1、1、10、100和1000 ug/L浓度组N2线虫vit-2和vit-6基因表达显著降低（P＜0.05）。以上结果表明,Tn BP和TCP抑制卵黄原蛋白相关基因（vit-2和vit-6）活性,从而诱导线虫内分泌干扰并调节线虫生殖毒性的形成。研究结论1、TCP、TBEP和TDBPP影响线虫的体长和体宽,可能导致发育毒性。Tn BP和TCP导致线虫的生殖能力降低和生殖腺发育受损,可能导致生殖毒性。2、Tn BP和TCP诱导线虫生殖毒性的潜在机制可能与四个方面有关:氧化应激、生殖细胞DNA损伤、生殖细胞凋亡和内分泌干扰。