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磷脂酶（Phospholipase）可水解磷脂产生不同的代谢产物,主要包括磷脂酶D（Phospholipase D,PLD）、磷脂酶 C（PLC）、磷脂酶 A1（PLA1）和磷脂酶 A2（PLA2）。其中,根据酶解底物特异性的不同,PLC可以分为PI-PLC（Phosphoinositides-specific PLC）和非特异性磷脂酶 C（Nonspecific phospholipase C,NPC）。PI-PLC 水解 PIP2（Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate）,产生 IP3（inositol 1,4,5-trisphophate）和二酰甘油（Diacylglycerol,DAG）,二者调控下游信号转导和细胞应答。NPC偏好水解磷脂酰胆碱（Phosphatidylcholine,PC）、磷脂酰乙醇胺（Phosphatidylethanolamine,PE）和溶血磷脂酸（Lysophosphatidic acid,lysoPA）等酯类,产生信号分子DAG和一个磷酸基团,参与感受和应答外界胁迫并传递信号。其中,人们对动植物中PI-PLC的生化特征、蛋白功能和信号传导等研究较为清楚,而对植物中NPC的功能研究较少,尤其是NPCs如何应答外界刺激并调控细胞应答及其分子机理,知之甚少。已有研究表明,NPC蛋白参与调控植物应答外界胁迫和调控细胞发育等过程,且拟南芥NPC3和NPC4可能参与生长素信号过程,而生长素信号途径不仅对植物生长、发育至关重要,也在植物缺素胁迫和逆境应答中行使重要功能。因此,研究植物NPC在高铵胁迫下的生物功能有助于揭示脂信号介导的生长素调控植物应答非生物胁迫的分子机制。拟南芥基因组中有6个基因编码NPC蛋白,命名为NPC1-6,基因编号分别为AT1G07230、AT2G26870、AT3G03520、AT3G03530、AT3G03540和AT3G48610。为了研究拟南芥NPC在高铵胁迫等不同处理下的生理性状,我们从拟南芥生物资源中心（Arabidopsis Resource Center,ABRC）购买了 NPC1-6 的 T-DNA 插入突变体株系:npc1（SALK027871）、npc2（SALK018011）、npc3（SALK065482）、npc4（SALK046713）、npc5（SALK045037）和npc6（SALK077041）,并从基因组水平利和转录水平等鉴定出纯合突变体。在50mMNH4+处理下,与野生型（WT）相比,npc3和npc4主根长度显著变短,而npc1/2/5/6突变体则无明显差异,暗示NPC3和NPC4可能介导高铵胁迫下主根伸长过程。我们利用qRT-PCR检测了高铵处理后NPC1-6基因表达情况,研究结果发现,50mMNH4+处理下,NPC1-6基因表达均呈现不同程度的下调。生长素（IAA）、脱落酸（ABA）、赤霉素（GA）、细胞分裂素（CTK）和甘露醇处理均诱导NPC1-6基因的表达。同时,我们利用启动子-GUS转基因材料证实了上述NPC3/4/5基因表达的诱导情况。另外,冻害处理实验结果表明,突变体npc3和npc5表现为冻害敏感表型,npc4与野生型无显著差异。上述结果表明,NPC3/4/5可能参与不同的激素和胁迫途径的调控过程。我们对WT和npc1-6突变体的根部向重力性和避盐性进行了比较和分析。在向重力方面,与WT相比,npc3/4在6h内表现为向重力性减弱,其他突变体无显著差异;在避盐性方面,在48 h和72 h处理时间内,npc1和npc6表现为避盐性减弱。我们在WT和npc3-5处理培养基中补充10 μM DAG,生长7天后统计主根根长和分生区长度。研究结果表明,高铵处理后,与WT相比,npc3和npc4突变体分生区显著变短,细胞数目减少,主根根长受抑制更明显,而且细胞死亡更多;外源补充DAG后,显著缓解了上述效应,恢复到野生型水平。上述结果表明,NPC3/4代谢产生的DAG可能直接参与高铵胁迫下根伸长和发育的调控过程。拟南芥官网TAIR网站BioGRID中预测NPC3与生长素输出载体蛋白PIN4存在互作。为了进一步证实二者的互作,我们分别构建了NPC1-6的原核表达载体,表达和纯化了重组蛋白并进行了 pulldown实验。Pulldown实验结果表明,NPC3/4/5与PIN4均能发生共沉淀,而与阴性对照PIN2无互作。我们进一步利用双荧光互补（BiFC）和免疫共沉淀（CoIP）技术核实,证实了 NPC3/4和PIN4互作较强,NPC5较弱,NPC1/2/6与PIN4无互作。上述研究结果表明,NPC3/4可能在蛋白水平调节PIN4蛋白的定位或者表达水平,间接调控生长素的极性运输和分布,从而调节根的发育和生长。综上所述,我们研究初步证实了 NPC3/4及其产物DAG可能通过调节PIN4转运活性,调控根部生长素的动态分布,以应答外界高铵等非生物胁迫,为后期深入研究磷脂介导的生长素信号调节网络提供了重要的证据和线索。