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自噬是真核细胞内溶酶体依赖的、降解细胞内生物大分子和受损细胞器的分解代谢过程,在控制细胞内物质更新,维持细胞内环境稳态过程中发挥重要作用。自噬功能障碍时,细胞内会积聚大量异常蛋白质和受损细胞器,使细胞生长和代谢机制发生紊乱,诱发多种人类疾病,如糖尿病、神经退行性疾病和肿瘤等。大量的研究结果显示,自噬对肿瘤的发生具有抑制作用。自噬缺陷引起细胞内p62蛋白、受损的线粒体、蛋白质聚合物和ROS等的累积,导致正常细胞向肿瘤细胞发生转化。肿瘤形成后,肿瘤细胞又能利用自噬对抗应激环境,增强其存活能力,促进肿瘤发展。肿瘤治疗过程中,抑制细胞自噬,能提高肿瘤放疗、化疗的敏感性。目前,自噬对肿瘤发生发展的调节机制研究是肿瘤研究的热点内容。细胞接触性抑制是调控组织生长与创伤修复的重要方式,细胞接触性抑制的丧失是正常细胞向肿瘤细胞转化的标志之一,Hippo-YAP信号通路在调节细胞接触性抑制过程中发挥重要作用。当细胞生长接触时,Hippo信号通路被激活,诱发促生长因子YAP蛋白的泛素化降解,进而抑制细胞生长。Hippo-YAP信号通路异常在多种肿瘤的发生过程中扮演关键角色。本研究中,我们发现野生型(wildtype,WT)的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)在高密度生长接触时表现出生长抑制现象,形成单层细胞。而重要自噬相关基因Atg5敲除的自噬缺陷Atg5-/-MEF细胞在高密度生长接触时,可以层叠生长,形成多层细胞克隆,提示自噬调节细胞接触性抑制作用的可能性。利用CRISPR-Cas9系统,我们又构建了自噬相关基因ATG5和ATG7特异敲除的人胚肾上皮细胞(HEK293),ATG5-/-和ATG7-/-HEK293细胞在高密度生长接触时仍然持续增殖,表现出层叠生长的现象。利用溶酶体抑制剂氯喹(Chloroeuine,CQ)和Class Ⅲ PI3K抑制剂渥曼青霉素(Wortmannin)干扰HEK293细胞的正常自噬过程,发现抑制自噬性降解或抑制自噬发生均能形成明显的多层细胞克隆。进一步研究发现,细胞高密度生长接触时,相较于野生型细胞中YAP蛋白的细胞质定位,Atg5-/-及Atg7-/-细胞中YAP仍明显定位于细胞核中,YAP蛋白水平显著升高,而mRNA水平无差异,提示YAP通过自噬-溶酶体途径降解的可能性。利用CQ抑制细胞自噬性降解,我们发现野生型HEK293中YAP蛋白水平呈现时间和浓度依赖性升高。免疫荧光实验结果显示,YAP能够与自噬泡的标记蛋白LC3共定位。这些结果证明,YAP可通过自噬途径被溶酶体降解。综上所述,我们的研究表明,细胞自噬能够降解促生长因子YAP,调节Hippo-YAP信号通路的活性。自噬功能障碍抑制YAP降解,造成细胞中YAP活性上升,导致正常细胞向肿瘤细胞发生转化,丧失接触性抑制作用。