研究背景:　　癌症已经成为一种常见病、多发病，严重的威胁着人类的健康。全世界每年新增的癌症患者约有1千万例，是导致人类死亡的第二大疾病。我国每年约有350万新增癌症患者，每年因癌症而死亡的人数将近250万人。目前对于癌症的传统疗法有：手术、放疗、化疗，然而他们不仅杀伤肿瘤细胞，也会导致机体的正常细胞出现一些无法避免的损伤，进而出现一些严重的并发症，导致患者终止治疗。对于一些不耐受手术、放化疗的患者，拒绝手术治疗的患者以及对化疗出现耐药的患者，迫切需要其他的治疗方法。　　光动力疗法（Photodynamic therapyPDT）是近20多年来临床上用于诊断与治疗肿瘤的一种新兴非手术治疗方法。光敏剂经口服或局部应用后，经过一段时间选择性聚集在肿瘤细胞与组织内，经特定波长光照射激发后，在分子氧的参与下，光敏剂发生光物理或化学反应产生单线态氧（1O2）等活性分子，直接导致肿瘤细胞的凋亡或坏死，或损伤肿瘤微血管，导致肿瘤细胞缺氧、营养匮乏而衰竭，同时 PDT可以诱导机体产生一系列免疫应答，促进树突状细胞（DCs）成熟与活化，进而活化 CD8+ T淋巴细胞而产生抗肿瘤作用。然而因PDT所使用的光穿透力等因素造成的对深部肿瘤组织和细胞杀伤力有限和光动力治疗后的复发等问题，仍然限制了PDT在临床上的应用。因此目前研究热点集中在更理想光敏剂的开发研究和影响PDT效应的因素与机理研究，另外有关机体免疫状态尤其是 PDT诱导的机体免疫反应对肿瘤细胞的杀伤也是目前研究的重点。　　在我们研究影响PDT效应的因素与机理过程中，蛋白4.1R是我们关注的重点之一。蛋白4.1R是最初在红细胞中分离而得到的、大小约为80KD的膜骨架蛋白，可以将血影蛋白-肌动蛋白与跨膜蛋白连接起来，维持着红细胞的形态与细胞的粘附、脆性及相关生理功能。随后，与4.1R具有很高同源性的其他3种蛋白被发现，分别为：4.1B、4.1N和4.1G。课题组前期研究发现，在CD4+T淋巴细胞中4.1R与免疫突触的形成有关，在CD8+T淋巴细胞中4.1R对它的活化、增殖起负调控作用。近年来也发现人类多种肿瘤中蛋白4.1家族成员表达异常，并且与肿瘤的侵袭转移相关。鉴于前期我们发现的蛋白4.1R在CD4+T细胞和CD8+T细胞活化过程中的作用，而PDT发挥杀伤肿瘤细胞的机制之一就是诱导抗肿瘤免疫反应，因此我们有理由猜测4.1R蛋白可能会影响到PDT效应。关于蛋白4.1R在PDT过程中的作用研究目前国内外还未见报道，其研究结论将对蛋白4.1R新功能的认识和寻找增强临床PDT疗效的方法提供基础。　　研究目的:　　本研究利用4.1R基因敲除型（4.1R-/-）和野生型（4.1R+/+）小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）为研究对象，了解细胞膜骨架蛋白4.1R对光动力效应的影响及可能存在的机制，为进一步了解蛋白4.1R的功能，甚至通过调控蛋白4.1R达到增强PDT效应的目的提供更多依据。　　研究方法:　　1.以4.1R基因敲除型（4.1R-/-）与野生型（4.1R+/+）小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）为研究对象，PCR体外扩增进行基因鉴定；Western blot法检测蛋白4.1R在两种细胞中表达形式；细胞免疫荧光法观察蛋白4.1R在细胞中定位；构建4.1R重组真核表达载体pEGFP-4.1R（80KD）与pEGFP-4.1R（135KD），脂质体法转染4.1R-/-MEF细胞。　　2.利用 CCK-8法检测单纯5-ALA在不同浓度及孵育时间下对4.1R-/-与4.1R+/+MEF细胞的暗毒性、单纯激光辐射对4.1R-/-与4.1R+/+MEF细胞的影响。　　3.光学显微镜下观察5-ALA-PDT后4.1R-/-与4.1R+/+MEF细胞形态学改变。　　4.利用CCK-8法比较不同5-ALA浓度、孵育时间及不同激光剂量作用下，5-ALA-PDT后4.1R-/-与4.1R+/+MEF两种细胞存活率变化。　　5.激光共聚焦显微镜观察5-ALA孵育后4.1R-/-与4.1R+/+MEF细胞合成PpIX在胞内的定位；荧光分光光度计检测5-ALA作用后4.1R-/-与4.1R+/+MEF细胞合成PpIX的情况。　　6. Western blot法检测4.1R-/-与4.1R+/+MEF细胞内原卟啉合成限速酶亚铁螯合酶（FECH）与胆色素原脱氨基酶（HMBS）表达情况。　　7.荧光分光光度计检测不同温度（4℃、37℃）条件下4.1R-/-与4.1R+/+MEF经5-ALA孵育后细胞合成PpIX的情况；荧光分光光度计检测抑制剂GABA、牛磺酸、β-丙氨酸作用后4.1R+/+MEF经5-ALA孵育后细胞合成PpIX的情况。　　研究结果:　　1. PCR结果表明，4.1R+/+MEF细胞cDNA经扩增后得到大小约为1700bp与2500bp两条条带，而4.1R-/-MEF细胞则为4.1R表达缺失；Western blot结果显示4.1R+/+MEF细胞中表达大小约为80KD与135KD两种4.1R蛋白亚型，而4.1R-/-MEF细胞则不表达蛋白4.1R；细胞免疫荧光结果显示蛋白4.1R分布于细胞膜周围；成功构建载体pEGFP-4.1R（80KD）与pEGFP-4.1R（135KD）并转染至细胞内。　　2.细胞暗毒性结果表明，单纯5-ALA在不同浓度及孵育时间下对4.1R-/-与4.1R+/+MEF细胞的生长几乎没有影响（P＞0.05），单纯激光辐射对两种细胞的存活率基本无影响（P＞0.05）。　　3.光学显微镜观察5-ALA-PDT后，4.1R-/-与4.1R+/+MEF均出现不同程度的细胞变圆、变小，崩解为细小颗粒，表现为死亡状态，且随着5-ALA孵育时间的增加细胞存活率逐渐减小，同一条件下，4.1R+/+ MEF细胞死亡程度高于4.1R-/-MEF细胞。　　4. CCK-8法检测5-ALA-PDT细胞存活率，结果显示：5-ALA-PDT均能杀伤4.1R-/-与4.1R+/+MEF两种细胞，且杀伤作用与5-ALA的孵育时间、浓度、激光辐射剂量相关，但两种细胞 PDT杀伤效果不同，两种细胞经1mmol/L的5-ALA孵育4h后，120mJ/cm2激光剂量作用时，4.1R-/-MEF与4.1R+/+MEF细胞存活率分别为46.9％±7.1与12.5%±2.1，有显著性差异（P＜0.001）。　　5.激光共聚焦显微镜观察5-ALA孵育后生成PpIX分布，结果显示4.1R-/-与4.1R+/+MEF细胞内均产生红色荧光，主要分布于胞膜与胞质中；荧光分光光度计检测结果表明：PpIX在409nm的光激发下发射出635nm波长红光，荧光强度随5-ALA浓度增加而增加，在1mmol/L基本达到饱和，此时4.1R+/+MEF胞内荧光强度显著高于4.1R-/-MEF（124.2±3.5 vs34.6±3.8，P＜0.001）。　　6.Western blot结果表明4.1R-/-MEF与4.1R+/+MEF细胞内限速酶FECH与HMBS表达量基本一致。　　7.荧光分光光度计检测结果表明：4℃条件下以及呼吸作用抑制剂作用下孵育5-ALA，4.1R-/-MEF与4.1R+/+MEF胞内几乎不产生PpIX，表明5-ALA主要通过主动运输进入细胞；提前孵育 GABA、牛磺酸、β-丙氨酸后胞内产生荧光强度均不同降低。　　研究结论:　　1.蛋白4.1R的缺失影响了PDT效果，导致PDT细胞杀伤能力下降，但并未影响5-ALA体内代谢途径。　　2.蛋白4.1R可能通过影响5-ALA的跨膜转运而影响原卟啉合成，进而影响PDT杀伤效应。其机理可能是蛋白4.1R参与影响了GABA、牛磺酸或β-丙氨酸等转运体对5-ALA的跨膜主动转运功能。