论文部分内容阅读
研究目的:活性氧（reactive oxygen species,ROS）是机体有氧代谢的产物。细胞或组织中氧自由基的产生和清除失衡,导致体内活性氧积累,进而加剧体内氧化应激反应。氧化应激存在于许多疾病中,如癌症、炎症、动脉粥样硬化、糖尿病、非酒精性脂肪肝等。此外,通过化学键将药物与荧光基团连接起来,制备自发荧光纳米递药系统,可以直接观察纳米递药系统在体内的输运和分布过程,避免了包载外加荧光指示剂与纳米递送系统分离的情况产生。本课题以脂溶性药物洛伐他汀（Lovastatin,Lov）和水溶性药物海藻糖（Trehalose,Tre）为药物模型,以苝酰亚胺（Perylene imide,PBI）为荧光指示剂,合成两种活性氧响应型荧光纳米前药,分别包裹磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine,PS）及透明质酸（Hyaluronic acid,HA）,构建主动靶向型纳米载药系统,并进一步研究两种纳米载药系统在治疗非酒精性脂肪肝和逆转巨噬细胞泡沫化方面的应用潜力。研究方法:1.PS-PBI-Lov纳米粒的构建、表征及其对非酒精性脂肪肝治疗的研究（1）PBI-Lov纳米前药的合成及鉴定将苝酰亚胺和洛伐他汀通过草酸酯键相连,得到PBI-Lov纳米前药,采用~1H NMR和FT-IR对每一步产物结构进行鉴定。（2）PS-PBI-Lov纳米粒的制备与理化性质的考察通过薄膜法制备PS-PBI-Lov纳米粒,对该纳米粒进行粒径电位、透射电镜、荧光性、稳定性考察以及在不同浓度下H2O2（0、0.1、1 mmol）的累积释药百分率。（3）PS-PBI-Lov纳米粒对非酒精性脂肪肝的研究通过自身荧光的特点,考察Hep G2细胞和巨噬细胞对纳米粒摄取情况的变化以及考察该纳米粒系统对细胞内活性氧含量的影响。通过尾静脉注射PS-PBI-Lov纳米粒溶液,比较该纳米粒系统在正常小鼠组和非酒精性脂肪肝小鼠组的分布情况。考察该纳米粒递药系统对治疗非酒精性脂肪肝模型小鼠的肝指数、肝部位油红O染色、HE染色以及Masson染色结果进行系统的分析。2.HA-PBI-Tre纳米粒的构建、表征及抑制巨噬细胞泡沫化进程的研究（1）PBI-Tre纳米前药的合成及鉴定将苝酰亚胺和海藻糖通过草酸酯键相连,得到PBI-Tre纳米前药,采用~1H NMR和FT-IR对每一步产物结构进行鉴定。（2）HA-PBI-Tre纳米粒的制备与理化性质的考察通过孵育法制备HA-PBI-Tre纳米粒,对该纳米粒进行粒径、电位、透射电镜、荧光性、载药量以及在不同浓度下H2O2（0、0.1、1 mmol）的累积释药百分率考察。（3）HA-PBI-Tre纳米粒抑制巨噬细胞泡沫化进程的研究通过自身荧光的特点,考察巨噬细胞对纳米载药系统摄取情况的变化,考察该纳米粒系统对细胞内活性氧水平的影响,研究该纳米粒系统对细胞内脂质变化的影响以及细胞内炎症因子水平变化的影响,研究其对巨噬细胞泡沫化进程的影响。研究结果:1.PS-PBI-Lov纳米粒的构建、表征及其治疗非酒精性脂肪肝的研究（1）使用~1H NMR和FT-IR对每一步产物结构进行鉴定,图谱证明了每一步均合成成功,最后得到PBI-Lov纳米前药。（2）PS-PBI-Lov纳米粒分布均匀,粒径为243 nm,电位为-34 mV。在4℃下储存,稳定性考察7天,粒径电位并没有发生太大波动,说明PS-PBI-Lov纳米粒水中分散均匀,并可在水中存放至少7天。PS-PBI-Lov纳米粒与PBI-Lov纳米前药的最大激发波长和最大发射波长一致,并没有发生变化。PBI-Lov纳米前药的累积释药百分率随着H2O2浓度增加而增加,但PS-PBI-Lov纳米粒由于磷脂酰丝氨酸层的作用,延缓了药物的释放速度。（3）通过流式细胞仪可以看出Hep G2细胞和巨噬细胞摄取PS-PBI-Lov纳米粒的荧光强度高于PBI-Lov纳米前药组。PS-PBI-Lov纳米粒也可以明显降低病变细胞内活性氧水平。通过活体成像技术观察PS-PBI-Lov纳米粒在体内的生物分布,对照组小鼠各脏器分布相对均匀,纳米粒荧光强度迅速降低,8小时后,小鼠体内几乎没有纳米粒的残留;在四环素小鼠组中,PS-PBI-Lov纳米粒的肝部位靶向分布增加,在肝脏部位的停留时间延长。油红O染色、HE染色以及Masson染色结果表明,PS-PBI-Lov纳米粒能改善肝脏受损情况,清除肝脏中蓄积脂质,恢复肝细胞规则排列,呈放射状分布,降低肝脏纤维化情况。2.HA-PBI-Tre纳米粒的构建、表征及减缓巨噬细胞泡沫化进程的研究（1）使用~1H NMR和FT-IR对每一步产物结构进行鉴定,图谱证明了每一步均合成成功,最后得到PBI-Tre纳米前药。（2）HA-PBI-Tre纳米粒分散均匀,粒径为228 nm,电位为-36.9 mV,载药量为62.5±8.6%,荧光强度随着纳米粒中苝的浓度增加而变化,并且PBI-Tre纳米前药的累积释药百分率随着H2O2浓度增加而增加,但HA-PBI-Tre纳米粒由于透明质酸层的作用,缓释药物体外释放速度。（3）细胞摄取实验表明,与PBI-Tre纳米前药相比,HA-PBI-Tre纳米粒更容易被巨噬细胞摄取。HA-PBI-Tre纳米粒可以降低泡沫细胞内活性氧的水平,0.5 h降低3.87倍,1 h降低9.87倍,2 h降低13.77倍,4 h降低13.18倍。细胞内脂质变化也随着给药浓度和给药时间变化而变化,总体而言,相比较海藻糖药物组,HA-PBI-Tre纳米粒组减缓巨噬细胞泡沫化的治疗效果更加显著（p＜0.05）。HA-PBI-Tre纳米粒也可以显著减少细胞内炎症因子水平（p＜0.05）。结论:本课题成功构建活性氧响应型荧光PS-PBI-Lov纳米粒递药系统,增加Hep G2细胞和巨噬细胞对药物的摄取,降低病变细胞内活性氧的含量,并且,该纳米粒递药系统对非酒精性脂肪肝具有一定的治疗前景。同时,本课题成功构建活性氧响应型荧光的PBI-Tre纳米前药和HA-PBI-Tre纳米粒主动靶向递药系统,增加巨噬细胞对药物的摄取,降低病变巨噬细胞内活性氧的含量,减缓巨噬细胞泡沫化进程。