研究背景和目的:多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome,PCOS）是生育期妇女常见的内分泌紊乱性疾病,以持续性无排卵和高雄激素的临床表现为主要特征,其病因和病理机制至今尚未完全阐明。在前期研究工作中,我们通过基因芯片杂交技术筛选出正常人和PCOS患者卵巢组织中290个差异表达的基因,NR4A1是该差异表达谱内代表性基因之一,在PCOS患者卵巢中表达下调（正常/PCOS=0.4）。既往研究表明,NR4A1在许多重要组织中均有表达,其功能涉及甾体激素代谢、细胞凋亡/增殖、胰岛素抵抗等诸多方面。因此,我们提出NR4A1可能与PCOS一系列病理生理改变相关的科研假说。为了探讨NR4A1在PCOS发生、发展过程中的作用,本研究分为两大部分:第一部分首先在蛋白水平证实了NR4A1在小鼠卵巢中的表达与定位,通过构建小鼠NR4A1重组腺病毒载体Ad-CMV-NR4A1及Ad-H1-SiRNA/NR4A1,分别实现NR4A1在小鼠卵泡膜细胞内的超表达和表达沉默,从而观察NR4A1在卵泡膜细胞内对雄激素合成的影响;第二部分探讨高雄激素作用下NR4A1的表达变化及小鼠未成熟卵泡颗粒细胞增殖、凋亡的情况,分别观察NR4A1超表达和表达沉默后,对颗粒细胞增殖、凋亡的影响。通过该研究,阐明NR4A1在PCOS病理生理机制中的作用,为多囊卵巢综合征研究提供新的思路。研究方法第一部分:NR4A1在小鼠卵巢中的表达及其对卵泡膜细胞雄激素生成的影响1.通过免疫组化方法研究NR4A1蛋白在小鼠卵巢中的表达和定位。2.构建小鼠NR4A1超表达重组腺病毒载体AdCMV-NR4A1及表达NR4A1基因的小分子干扰RNA（small interfering RNA , siRNA）重组腺病毒载体AdH1-NR4A1,重组病毒感染体外培养的小鼠卵泡24 h后,Western印迹验证NR4A1在卵泡膜细胞中的超表达及干涉效果。3. Real-time RT-PCR检测NR4A1超表达及干涉后对雄激素生成酶（StAR、CYP11A1、CYP17A1、HSD3B2）的转录调节,放射免疫法测定培养液中睾酮的浓度。4.用福斯高林（Forskolin,cAMP/PKA通路激动剂）分别处理小鼠卵泡1小时、2小时、4小时、6小时后,Realtime PCR检测NR4A1及雄激素生成相关酶的表达水平。第二部分:高雄激素作用下NR4A1的表达及其对颗粒细胞增殖、凋亡的影响1.用10^-4mol/L、10^-5mol/L、10^-6mol/L睾酮分别处理小鼠窦前卵泡后,观察卵泡的形态变化;通过MTT、流式细胞仪测定细胞周期、AnnexinV/PI及Caspase-3活性检测等方法分别观察雄激素作用后颗粒细胞的增殖与凋亡情况。2.通过Real-time RT-PCR、免疫组化、Western blot检测NR4A1在正常大鼠及PCOS大鼠模型卵巢组织中的表达。3.用不同浓度的睾酮分别处理体外培养的小鼠窦前卵泡,Real-time RT-PCR、Western blot检测NR4A1的表达变化。4.用睾酮及LY294002处理未成熟小鼠卵巢颗粒细胞后,Western blot检测Akt的蛋白磷酸化水平及NR4A1的表达。5.用Ad-CMV-NR4A1及Ad-H1-SiRNA/NR4A1重组腺病毒载体感染小鼠卵巢颗粒细胞48h后,检测NR4A1超表达及表达沉默后对颗粒细胞增殖、凋亡的影响。研究结果第一部分:NR4A1在小鼠卵巢中的表达及其对卵泡膜细胞雄激素生成的影响1. NR4A1蛋白在小鼠卵巢各级卵泡和间质内均有表达,其主要定位于卵泡膜细胞和颗粒细胞的细胞核。2.重组病毒Ad-CMV-NR4A1感染卵泡膜细胞后,与对照组相比,NR4A1超表达组NR4A1蛋白的表达水平显著升高,两组间差异显著（p<0.05）。NR4A1在卵泡膜细胞内超表达后明显促进了卵泡膜细胞雄激素生成相关酶（StAR、CYP11A1、CYP17A1、HSD3B2）mRNA的转录,增加睾酮合成。相反,重组病毒Ad-H1-siRNA/NR4A1感染卵泡膜细胞后,与对照组相比,NR4A1干涉组NR4A1蛋白的表达水平显著降低（p<0.05）。NR4A1在卵泡膜细胞内干涉后明显地抑制了StAR、CYP11A1、CYP17A1、HSD3B2 mRNA的表达,降低睾酮合成。3.在卵泡培养液中加入福斯高林后,NR4A1的表达迅速增加,随后StAR、CYP11A1、CYP17A1、HSD3B2的表达增加。第二部分:高雄激素作用下NR4A1的表达及其对颗粒细胞增殖、凋亡的影响1.在小鼠窦前卵泡体外培养的过程中,10^-4mol/L和10^-5mol/L睾酮能够显著促进卵泡体积的增加（p<0.05）;在10^-5mol/L睾酮的作用下,小鼠卵巢颗粒细胞的增殖增加,凋亡减少（p<0.05）。2. Real-time RT-PCR及Western blot结果显示NR4A1在PCOS大鼠模型卵巢中的表达明显低于其在正常大鼠卵巢中的表达（p<0.05）。3.用10^-5 mol/L和10^-4 mol/L睾酮处理卵泡24h及48h后均明显抑制NR4A1的表达（p<0.05）。4.用10^-5mol/L睾酮处理颗粒细胞10min至30min,Akt蛋白磷酸化水平显著升高（p<0.05）; LY294002预处理后,明显抑制睾酮作用下的Akt的磷酸化（p<0.05）,增加NR41的表达（p<0.05）。5. NR4A1在颗粒细胞内超表达后促进颗粒细胞的凋亡,抑制其增殖（p<0.05）;相反,NR4A1在颗粒细胞内表达沉默后抑制颗粒细胞的凋亡,促进其增殖（p<0.05）。结论1. NR4A1在小鼠卵巢的卵泡膜细胞和颗粒细胞内表达,提示NR4A1参与卵泡膜细胞和颗粒细胞内某种（些）生物学过程的调控。2.在cAMP/PKA信号通路作用下,NR4A1在卵泡膜细胞内促进雄激素生成酶的转录,进而促进雄激素生成。3.高雄激素促进颗粒细胞增殖、抑制颗粒细胞凋亡,从而促进早期卵泡发育。体内体外实验证明,高雄激素降低卵巢颗粒细胞中NR4A1的表达,可能与此相关。4.高雄激素作用下,通过PI3-K/Akt通路下调颗粒细胞内NR4A1的表达,NR4A1表达下调参与了颗粒细胞的增殖、凋亡调控过程,从而影响未成熟卵泡发育。5.本研究部分阐明了NR4A1在PCOS病理生理机制中的作用。