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研究目的:本实验分别从动物、细胞模型研究受体操纵性通道在柔红霉素诱导心肌损伤中的作用及其病理生理学意义。研究内容:重拟柔红霉素发生心肌损伤环境,建立柔红霉素产生的心肌组织与细胞损伤模型,探讨受体操纵性钙通道在柔红霉素诱导的心肌损伤中的作用,通过检测大鼠左心室内压、心肌形态学变化,并从免疫荧光、Real-time PCR及Western Blot检测方法从器官-细胞-分子三个不同水平检测动物、细胞两种柔红霉素心肌损伤模型中受体操作性钙通道在DNR诱发心肌损伤过程中的生理和病理生理机制,为将来防治蒽环类药物化疗过程中心肌毒性作用提供新靶点与思路。研究方法:【动物模型】SD雄性大鼠,110g~130g,20只随机分两组每组10只,正常组(Control)、模型组(DNR)。DNR组腹腔注射柔红霉素,按2.5mg/kg,每周1次,连续4周。正常组,腹腔注射等体积生理盐水;各组大鼠末次给药后1周,行左心室插管、心肌酶检测、血流动力学检测,同时行HE染色观察心肌结构变化、Real-time PCR、Western Blot检测心肌TRPCs表达。【细胞模型】体外分离培养乳鼠(出生1-3d)心肌细胞,正常组、柔红霉素组(1μM DNR处理24h),取细胞培养上清液测LDH和CK,用免疫荧光技术,实时荧光定量PCR、Western Blot等方法检测各组细胞存活率及TRPCs表达情况。进一步分组DNR+OAG组(100μM OAG,ROCC受体激动剂预先处理2h,再1μM DNR处理24h)、DNR+CPA组(10μM CPA,SOCC受体激动剂预先处理2h,再1μM DNR处理24h)、DNR+SKF组(5μM SKF96365,ROCC受体阻断剂预先处理2h,再1μM DNR处理24h),用MTT检测各组细胞增殖情况。研究结果:【动物模型】大鼠持续4周腹腔注射柔红霉素使大鼠出现心肌损伤表现,表现活动减弱、精神状态差、体重增加缓慢、腹泻、且有死亡,可检测心肌损伤酶增加,左心室收缩、舒张功能减弱,心肌实质细胞减少,结构损伤性变化,与正常组对比,柔红霉素组的LDH和CK均增加(p<0.05)。大鼠左心室插管,与正常组对比,柔红霉素组大鼠mLVDP降低(P<0.05),心率减缓(P<0.05)、LVP-dp/dtmax降低(P<0.05)、LVP+dp/dtmax降低(P<0.05),与正常组比较,柔红霉素心肌损伤组mLVP、mLVSP并无明显差异。大鼠心肌组织HE染色,正常组心肌纤维排列规整,核染均一,少有炎性细胞;柔红霉素组心肌细胞核大、畸形、深染、心肌纤维紊乱,胞质呈溶解状态,炎性细胞增多。Real time PCR检测结果表明,与正常组比较,柔红霉素组TRPC3和TRPC6的mRNA增加(P<0.05)。大鼠心肌Western Blot检测结果表明,与正常组比较柔红霉素组TRPC6蛋白表达上调(P<0.05),与Control组比较,DNR组大鼠心肌组织中TRPC3、TRPC7蛋白表达未见明显差异。【细胞模型】镜下观察:原代培养乳鼠心肌细胞,心肌细胞可交织成网,可见心肌细胞以统一的节律成片搏动,生长状态良好可用于制备模型。与正常组比较,柔红霉素1μM共培养24h生存率为75.08±1.26%(P<0.05),故损伤组的柔红霉素浓度定为1μM,建立细胞损伤模型。同时观察形态学改变发现:1μM DNR处理24 h,细胞失去正常梭形或星形形态,胞核固缩,胞浆空泡化。与正常组比较,柔红霉素组中CK、LDH增加(P<0.05)。PCR检测:与正常组比较,柔红霉素组TRPC3、6、7 mRNA增加(P<0.05)。DNR组乳鼠心肌细胞Western Blot检测结果表明,与正常组比较DNR组TRPC6蛋白表达上调(P<0.05),TRPC3、TRPC7蛋白表达无明显差异。与正常组比较,单独使用OAG、CPA、SKF96365对正常乳鼠心肌细胞生存率无明显影响。与正常组比较,DNR组乳鼠细胞生存率降低(P<0.05),与DNR组比较DNR+SKF组细胞生存率增加(P<0.05),与DNR组比较DNR+OAG组细胞生存率降低(P<0.05),与DNR组比较DNR+CPA组细胞生存率无明显差异。免疫荧光镜下观察可见TRPC6抗体荧光是绿色,而被DAPI染色的细胞核荧光是蓝色。与Control组比较,DNR组乳鼠心肌细胞TRPC6免疫荧光剂在损伤心肌细胞中沉积呈阳性,Control组乳鼠心肌细胞免疫荧光剂在正常细胞中沉积较少呈弱阳性。结论:1.SD大鼠腹腔注射柔红霉素能够制备心肌损伤动物模型,乳鼠心肌细胞与柔红霉素共培养24h可制备柔红霉素损伤细胞模型,柔红霉素通过诱导心肌细胞损伤,促进左心室重构,从而引起左心功能降低;2.柔红霉素致动物与细胞心肌损伤模型中TRPC3、TRPC6、TRPC7 mRNA表达均增加,其中TRPC6蛋白表达量也显著增加,因此增强的TRPC6/ROCC所介导的蛋白功能,可能是柔红霉素致心肌损伤过程中的重要环节。本研究作为防治疗蒽环类药物心脏毒性提供重要科研理论依据,为开发新的临床防治策略提供新的思考。