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背景和目的Grainyhead-like 3(GRHL3)是Grainyhead-like(Grhl)家族的成员之一,Grhl基因家族有三个成员,与果蝇的grainy head基因家族同源。Grhl基因家族在个体发育和表皮屏障形成中是不可缺少的。GRHL3作为转录因子,表达在分化后的上基底层,能调控表皮分化过程中的多个基因,从而对表皮分化及屏障形成产生影响。有研究表明,GRHL3通过激活同源性磷酸酶-张力蛋白(PTEN)抑制鳞状细胞癌,同时GRHL3在发育早期的表皮迁移过程中发挥重要作用。SNXs是一个大的蛋白家族,参与细胞内吞、细胞内的蛋白转运及细胞信号转导等过程。人的snx16野生型基因编码的SNX16蛋白由344个氨基酸残基组成,含有两个结构域,PX结构域(吞噬细胞氧化酶同源域)和colied-coil结构域。PX结构域能与磷脂酰肌醇-3-磷酸(PI-3P)结合,使SNX16靶向的与胞内体结合。colied-coil结构域介导SNX16在溶酶体的定位,缺乏colied-coil结构域的SNX16不能定位到溶酶体。PI-3P主要存在于胞内体膜上。PI-3P的合成由PI-3P激酶催化。SNX16分布于粘着斑(细胞与胞外基质连接部位)附近的膜泡上,这些膜泡是Rab5阳性的。SNX16在粘着斑附近的分布依赖于活化的SNX23(驱动蛋白家族成员)、微管及PI-3P激酶。SNX16膜泡除了存在于胞质核周区以外,还存在于细胞质膜处。SNX16分布于多种肿瘤细胞,如MCF-7细胞、Hela细胞、Hep G2细胞、Bel7402细胞及NCI-H460细胞等。在小鼠的脑和肌肉细胞中也检测的SNX16的表达。在MCF-7细胞中使用si RNA敲低SNX23,破坏了SNX16在细胞膜的分布,同样使用秋水仙素处理MCF-7细胞也破坏了SNX16细胞质膜定位。使用细胞松弛素B对SNX16没有影响。在MCF7细胞中过量表达SNX16抑制细胞的迁移,反之,当敲低SNX16时,MCF7细胞的迁移能力增加;而过量表达或敲低SNX16,对细胞的增殖能力没有影响。SNX16转染的MCF7细胞注射裸鼠,肿瘤形成活性明显降低。由此可见,SNX16在细胞迁移及肿瘤形成过程中具有重要的作用。但其调控表达的分子机制尚不清楚。我们前期研究转录因子GRHL3对肿瘤细胞生物学行为时发现:过量表达GRHL3的肿瘤细胞迁移和侵袭能力明显增加;已证实这种生物学行为的改变与GRHL3调控的靶基因E-cadherin表达减少有关。同时对稳定干涉GRHL3的A431细胞进行基因表达谱分析发现,GRHL3稳定干涉后SNX16表达水平明显增加(较对照组增加4.5倍)。本研究为探讨GRHL3是否参与调控SNX16表达而改变肿瘤细胞的迁移和侵袭能力有关。方法将人GRHL3的c DNA克隆到带有FLAG标签的p CMV-2B表达载体中构建重组载体,将测序验证正确的重组载体(p CMV-2B-FLAG-GRHL3)转染到A431细胞和MCF7细胞中,用G418进行筛选从而构建稳定表达GRHL3的细胞系(A431-GRHL3、MCF7-GRHL3)。利用抗Flag抗体进行Ch IP,以捕获GRHL3特异性结合的DNA,并对这些DNA进行高通量测序。将Ch IP-seq所获得snx16基因所在染色体Chr8的数据输入UCSC数据库,观察到GRHL3在snx16基因启动子区域的结合峰。为了探讨GRHL3抑制SNX16表达的分子机制,利用生物信息学方法,分析了人的snx16基因启动子序列,发现snx16基因启动子区域存在2个潜在的GRHL3特异性结合位点(site1-2);我们克隆snx16启动子进行双荧光素酶实验,GRHL3降低了荧光强度,提示GRHL3抑制snx16启动子的活性;分别突变SNX16启动子上的结合位点,结果发现同时突变近端启动子上site1和site2时,GRHL3对其无明显抑制作用。Western blot结果显示:与低侵袭能力细胞系A431和MCF7相比,在高侵袭性的MDA-MB-231中GRHL3表达明显增高,而而SNX16的表达水平明显降低。过量表达GRHL3后,A431和MCF7中SNX16表达减少。因此,GRHL3可能参与调控SNX16的表达,并具有明显的负调控作用。细胞迁移和侵袭实验结果证实:在低侵袭性的A431细胞和MCF7细胞中过表达GRHL3后,细胞的迁移能力和侵袭能力明显提高。结果将人GRHL3的c DNA克隆到带有FLAG标签的p CMV-2B表达载体中构建重组载体,将测序验证正确的重组载体(p CMV-2B-FLAG-GRHL3)转染到A431细胞和MCF7细胞中,用G418进行筛选从而构建稳定表达GRHL3的细胞系(A431-GRHL3、MCF7-GRHL3)。将Ch IP-seq所获得snx16基因所在染色体Chr8的数据输入UCSC数据库,观察到GRHL3在snx16基因启动子区域的结合峰。为了探讨GRHL3抑制SNX16表达的分子机制,利用生物信息学方法,分析了人的snx16基因启动子序列,发现snx16基因启动子区域存在2个潜在的GRHL3特异性结合位点(site1-2);我们克隆snx16启动子进行双荧光素酶实验,GRHL3降低了荧光强度,提示GRHL3抑制snx16启动子的活性;分别突变SNX16启动子上的结合位点,结果发现同时突变近端启动子上site1和site2时,GRHL3对其无明显抑制作用。Western blot结果显示:与低侵袭能力细胞系A431和MCF7相比,在高侵袭性的MDA-MB-231中GRHL3表达明显增高,而GRHL3和SNX16的表达水平呈负相关。过量表达GRHL3后,A431和MCF7中SNX16表达减少。因此,GRHL3可能参与调控SNX16的表达,并具有明显的负调控作用。细胞迁移和侵袭实验结果证实:在低侵袭性的A431细胞和MCF7细胞中过表达GRHL3后,细胞的迁移能力和侵袭能力明显提高。结论GRHL3和SNX16的表达水平负相关性的特点;GRHL3抑制SNX16的表达,并促进肿瘤细胞的迁移和侵袭;其分子机制是通过直接或间接地结合于SNX16近端启动子上的site1和site2进而调控SNX16的表达。