研究背景卵巢功能不全(Primary ovarian insufficient,POI)是妇科常见的内分泌疾病之一。生育能力降低,围绝经期症候群等症状严重困扰着女性的生殖健康和正常生活。大量科学研究证实,POI是与环境和遗传有关的多基因遗传病,发病机制尚未明了。表观遗传学是将环境因素和遗传因素连接起来的重要环节,目前备受关注。DNA甲基化作为表观遗传修饰的重要手段一直是研究的热点,但是针对POI甲基化研究主要集中在单个基因或一些基因。随着科学技术的飞速发展,在全基因组范围内了解甲基化变化成为可能。本研究分析了 POI的全基因组DNA甲基化变化谱,筛选出甲基化差异候选基因,心脏型脂肪酸结合蛋白基因(Heartfatty acid-binding protein,H-FABP,FABP3)。FABP3 作为脂肪酸结合蛋白(Fatty acid-binding proteins,FABPs)家族成员之一,是细胞内的一种小分子蛋白。它能可逆性的与疏水性配体结合,参与细胞内脂肪酸的摄取、转运和代谢。因此FABP3在脂质代谢过程中起着重要的作用。脂代谢异常与卵巢功能不全存在密切的关系,因此推测在POI的发生和发展中脂肪酸结合蛋白3可能有一定的作用。研究目的全面分析卵巢功能不全中颗粒细胞DNA甲基化变化谱,筛选甲基化差异候选基因,明确甲基化差异候选基因在POI中的作用。研究方法收集2例POI患者以及3例卵巢功能正常女性的卵泡液,分离颗粒细胞;利用试剂盒提取颗粒细胞的DNA;然后将DNA进行甲基化全基因组亚硫酸氢盐测序的文库制备;最后在Illumina HiSeq平台上进行PE125/PE150测序和分析,筛选出甲基化差异基因。最终本研究得到POI的甲基化差异候选基因,FABP3基因。利用Crispr-cas9技术在人颗粒细胞瘤永生化细胞系(KGN)中建立FABP3基因敲除KGN细胞,对该细胞系进行后续检测。首先,检测雌二醇水平和细胞的增殖能力;第二步,检测雌二醇生物合成限速酶基因(CYP19A1)的变化;第三步,利用DNA pull down技术,寻找与CYP19A1基因启动子结合蛋白并对其进行相关分析;第四步对FABP3基因敲除KGN细胞的游离脂肪酸及相关基因进行了测定。研究结果分析卵巢功能不全的颗粒细胞全基因组DNA甲基化谱结果显示,POI实验组与卵巢功能正常对照组总体DNA甲基化水平无统计学差异;DNA甲基化在基因组中的分布模式是:在转录起始位点甲基化水平急剧下降,从转录起始位点向下游甲基化水平逐渐增高至平台期;对差异甲基化区域和差异甲基化基因进行GO和KEGG分析,差异甲基化基因被富集在210个GO亚类中和56个KEGG通路中;对差异甲基化基因分析,筛选出POI的候选基因,心脏型脂肪酸结合蛋白3基因;在敲除FABP3基因的KGN细胞系出现了类似POI的表型——KGN细胞分泌分泌雌二醇水平降低,细胞增殖能力下降;与对照组KGN细胞比较,敲除FABP3基因的KGN细胞系雌激素合成的限速酶芳香化酶基因(CYP19A1)的基因表达和蛋白水平均有下调;与CYP19A1基因启动子直接结合的蛋白是核转录因子κB(NF-κB),NF-κB的抑制性蛋白α(IκBα)基因表达水平和蛋白水平也上调;游离脂肪酸水平也有明显增高,差异均有统计学意义。过表达过氧化物酶受体α(PPARα)基因的KGN细胞系也表现出敲除FABP3基因KGN细胞系的表型。研究结论明确了卵巢功能不全中颗粒细胞DNA甲基化变化谱,筛选出了与POI甲基化差异候选基因,即FABP3基因。FABP3基因介导了敲除FABP3基因的KGN细胞系中雌二醇的下调,具体机制是:负责脂肪酸细胞内转运的脂肪酸结合蛋白3被敲除后,导致细胞中游离脂肪酸升高;升高的游离脂肪酸活化了 PPARα;PPARα基因促进了 IκBα基因的表达,从而抑制了 NF-κB的入核,导致CYP19A1基因表达下调,最终导致雌二醇的生成降低。这为探索POI的发生机制提供了新的理论基础。