妊娠毒血症（pregnancy toxemia,PT）是妊娠末期绵羊常见的一种营养代谢性疾病,以酮血、酮尿为特征。该病主要发生于怀多羔的母羊,给养羊业造成了巨大的经济损失。然而,绵羊PT的发病机制尚未完全阐明。多项研究指出,作为酮体主要组成部分的β-羟基丁酸（β-hydroxy butyric acid,BHBA）和非酯化脂肪酸（non-esterified fatty acids,NEFAs）在绵羊PT的发生过程中扮演了重要的角色。肝脏是动物机体能量代谢的主要器官,而高浓度的BHBA和NEFAs对绵羊肝细胞的作用机制尚不清楚。此外,多项研究表明,中药具有提高免疫力、调节机体代谢、抗氧化应激等多种药理作用。因此,本试验通过分离培养绵羊原代肝细胞,分别研究BHBA和NEFAs对肝细胞脂代谢、氧化应激及炎症通路的影响,并以BHBA和NEFAs共同刺激绵羊原代肝细胞构建细胞损伤模型,探讨加味一贯煎抗BHBA和NEFAs致肝细胞损伤的效果及作用机制;采用高分辨非靶向代谢组学技术对PT绵羊与正常绵羊血液进行检测,进一步阐明绵羊PT的发病机制。结果如下:1.采用胶原酶两步灌流法成功分离并培养了绵羊原代肝细胞,所得肝细胞形态完整,贴壁良好,存活率平均为92%;PAS和CK-18荧光染色呈阳性,细胞纯度大于95%,可用于进一步试验研究。2.分别用0、0.6、1.2、1.8、2.4、4.8 mmol/L BHBA和0、0.4、0.8、1.2、1.6、3.2mmol/L NEFAs处理绵羊原代肝细胞。结果显示,绵羊肝细胞的活力与BHBA、NEFAs的浓度呈时间剂量依赖效应,随着BHBA、NEFAs浓度的增加,绵羊肝细胞的活力显著受到抑制;低浓度的BHBA和NEFAs可以激活AMPK通路、Nrf2通路,而高浓度的BHBA和NEFAs则显著提高VLDL、TG、T-CHOL的水平,增强ALT、AST的活性,抑制AMPK通路、Nrf2通路,并激活NF-κB通路,但各浓度的BHBA对ATGL、HSL的m RNA表达无显著影响。以上结果表明,低浓度的BHBA和NEFAs通过活化AMPK通路和Nrf2通路来抑制细胞脂质合成、促进脂质氧化,并提高肝细胞的抗氧化应激能力。而高浓度的BHBA和NEFAs则通过抑制AMPK通路、Nrf2通路以及激活NF-κB通路来促进脂质合成、抑制脂质氧化,并引起细胞炎症反应。此外,BHBA对肝细胞的脂解作用有限,但低浓度的NEFAs可以提高肝细胞的脂解能力,高浓度的NEFAs则抑制肝细胞的脂解,最终导致肝细胞脂质代谢紊乱和损伤。3.根据绵羊PT的诊断指标以及不同浓度BHBA、NEFAs对绵羊肝细胞的影响,确定采用1.8 mmol/L BHBA、1.6 mmol/L NEFAs处理24 h用于肝细胞损伤模型的筛选。分别设定对照组、BHBA处理组、NEFAs处理组、BHBA+NEFAs共处理组,按上述分组处理绵羊肝细胞24 h。结果表明,BHBA和NEFAs联合应用可加重对绵羊肝细胞的损伤程度,更适合模拟绵羊PT的肝细胞内环境。4.在BHBA和NEFAs联合诱导的绵羊肝细胞损伤模型上,评价加味一贯煎对细胞模型的保护效果及作用机制。结果如下,加味一贯煎作用于绵羊原代肝细胞的安全用药浓度在2000μg/m L以内。与模型组相比,400、800、1200μg/m L加味一贯煎均能够在不同程度上降低VLDL、TG、T-CHOL的水平,抑制ALT、AST的活性,并激活AMPK通路和Nrf2通路,但对NF-κB通路的影响不显著。以上结果表明,加味一贯煎可以通过调控AMPK和Nrf2通路来抑制BHBA和NEFAs引起肝细胞损伤反应,促进脂质分解,抑制脂质合成,并提高抗氧化应激能力。5.采集PT绵羊与正常绵羊血液,每组5个样本,运用高分辨非靶向代谢组学技术鉴定PT绵羊与正常绵羊血液差异代谢物,通过单变量统计分析及PCA、PLS-DA、OPLS-DA等多元统计分析,筛选出PT绵羊血液差异代谢物,进行生物信息学分析。结果显示,共获得亚油基肉碱、甘氨酸、甜菜碱、3-羟基丁酸、棕榈酸、甘露甾醇等25个显著性差异代谢物,其中9种上调,16种下调,这些物质涉及脂肪酸、氨基酸等。KEGG富集分析和通路注释分析发现,这些显著性差异代谢物主要参与了三磷酸腺苷结合盒转运蛋白,2-氧羰基酸代谢等代谢途径,定位于新陈代谢、遗传信息处理等生物过程中。基于以上研究,BHBA和NEFAs可通过AMPK、NF-κB和Nrf2三个信号通路来调节绵羊肝细胞的脂质代谢、氧化应激和炎症状态;加味一贯煎可通过调控AMPK通路和Nrf2通路来促进脂质分解,抑制脂质合成,增强抗氧化应激能力,以缓解BHBA和NEFAs联合诱导的绵羊肝细胞损伤;代谢组学技术揭示了绵羊PT的发生主要是通过调节三磷酸腺苷结合盒转运蛋白,2-氧羰基酸等代谢途径,对体内代谢状态和多个生物系统功能产生影响。