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近年来关于肿瘤遗传易感性的研究倍受关注。肿瘤的发生过程多是由易感基因与环境等冈素相互作用所决定的。易感基因在肿瘤的发病过程中发挥着重要作用。肽基精氨酸脱亚胺酶4(PADI4)作为一种翻译后修饰酶能将底物蛋白的精氨酸残基催化生成瓜氨酸。本课题组前期研究已发现PADI4在结直肠癌、食管癌、乳腺癌等绝大多数恶性肿瘤及患者血液中有特异高表达,并通过修饰抗凝血酶、细胞角质蛋白和细胞纤维连接蛋白刺激肿瘤毛细血管增生和抑制细胞凋亡。该结果已被国外两所实验室证实,SCI论文他引30次。最近有人发现PADI4可与P53组成分子开关调控抑癌基因的表达。可见,PADI4在肿瘤癌变过程中起着非常重要的作用,有可能是肿瘤易感基因。国外已有实验室将皮肤基底癌易感基因定位于1p36,而PADI4恰好位于该区域。但目前国内外均没有对PADI4基因组单核苷酸多态性(SNP)与肿瘤之间的相关性进行研究。PADI4基因组DNA上是否会有SNP通过影响蛋白的表达量、结构或者功能而参与肿瘤病变过程也无人知晓。我们首先用基因芯片对PADI4基因上的74个tagSNP进行了筛选,发现有多个位点与结直肠癌、食管癌、乳腺癌等恶性肿瘤呈强相关性。为验证芯片结果,本研究采用大样本,用TaqMan-PCR的方法对筛选到的肿瘤相关的tagSNP包括rS1886302、rs2477131、rs1635561和rs1635567位点进行基因分型,分析上述位点是否与结直肠癌、食管癌、乳腺癌易感性相关。
目的：在实验室前期工作基础上,从基因组水平深入研究PADI4的基因多态性与结直肠癌、食管癌、乳腺癌易感性的关系,分析PADI4的SNP位点等位基因/基因型与结直肠癌、食管癌、乳腺癌之间的关联性,证明PADI4是三种恶性肿瘤的易感基因。
方法：本研究采用“病例-对照”的方法,实验对象包括515例结直肠癌患者(女性179例,平均年龄55.93±12.04)、707例食管癌患者(女性224例,平均年龄52.29±11.79)和的191例乳腺癌患者(全部女性,平均年龄47.80±10.43),以及549例健康人群(女性192例,平均年龄46.44±12.96)作为结直肠癌和食管癌的对照,329例女性(平均年龄44.89±13.47)作为乳腺癌的对照。本实验按如下步骤进行：⑴根据国际人类基因组单倍体型图计划(http://www.hapmap.org/)公布的SNP数据,优先选取最小等位基因频率大于0.05,位于外显子区域、3和5调控区以及外显子内含子交界处上(下)游1000bp内的tagSNP作为遗传标记定制基因芯片。⑵应用Omega E-Z96血液基因组DNA提取试剂盒(E-Z96 Blood DNA Kit)提取肿瘤患者和健康对照血液全基因组DNA;⑶选取每种肿瘤120例/正常对照150例利用基因芯片进行基因分型和统计分析。根据芯片结果筛选出4个tagSNP位点包rs1886302、rs2477131、rS1635561和rs1635567。然后对四个位点在515例结直肠癌、707例食管癌以及549例健康对照中采用TaqMan-PCR方法进行了验证,对rs2477131和rs1635561位点在191例乳腺癌和329例女性对照中采用同样方法进行了验证。⑷拟合优度x2检验(Goodness-of-fit Chi-square test)分析病例、对照组基因型频率的分布是否符合H-W平衡;⑸分别基于基因型和等位基因频率的“病例-对照”关联分析,其中基因型分析在3种遗传模式下应用SPSS11.5软件进行非条件Logistic回归模型分析评估单个点基因型与恶性肿瘤发生风险的相关程度,并计算优势比(OR)及95％可信区间(CIs);⑹连锁不平衡和单倍体型分析:应用Haploview4.0软件计算以上位点组成的单倍体型,并用SHEsis软件分析每种单倍体型在病例组和对照组之间的分布差异;⑺SNP位点基冈型与性别关联分析:用SPSS11.5软件分别计算结直肠癌组、食管癌组不同性别之间的基冈型分布差异。
结果：①流行病学资料分析:结直肠癌、食管癌、乳腺癌组和相应的对照组之间年龄、性别分布无统计学差异(P>0.05)。②病例组和对照组H-W平衡检验:结直肠癌组、食管癌组以及对照组中rs1635567位点基因型分布不符合H-W平衡(P<0.05),故在后续的结果分析中舍弃这个位点。另外的3个位点基因型在病例组以及它们各自的对照组中均符合H-W平衡(P>0.05)。③SNP位点等位基因多态性分析结果:结直肠癌组与对照组分析发现rs1886302位点等位基因频率分布差异有统计学意义,(P=0.036)。而食管癌组与对照组中rs1886302、rs1635561和rs2477131位点等位基因频率分布差异无统计学意义(P>0.05)。乳腺癌与对照组的rs163556l和rs2477131个位点等位基因频率分布差异也无统计学意义(P>0.05)。④SNP位点基因型多态性分析结果:结直肠癌与对照组比较rs1886302位点显性遗传模式差异有显著意义(P=0.040)。食管癌组与对照组比较,rs1886302、rs1635561和rs2477131位点的3种遗传模式差异均无统计学意义(P>0.05)。乳腺癌组与对照组比较,rs1635561和rs2477131位点也无统计学意义(P>0.05)。⑤PADI4基因单体型分析结果:连锁不平衡分析发现rs1886302与rs2477131位点紧密连锁,可组成3种单体型,AA、GA、GG,但是统计分析并没有发现与结直肠癌、食管癌易感性相关的阳性单体型(P>0.05)。⑥性别关联分析结果:结直肠癌组中rs1886302位点男性和女性基因型分布差异有统计学意义(P<0.05),食管癌组rs1635561和rs2477131位点男性和女性基因型分布差异均无统计学意义(P>0.05)。
结论：本研究发现rs1635561和rs2477131位点与结直肠癌、食管癌、乳腺癌易感性不相关,rs1886302位点与结直肠癌易感性相关,进一步分析可知A等位基因或AA基因型对结直肠癌发病有保护作用,且该位点的基因型频率分布在结直肠癌病例组中有性别差异。由此可以说明PADI4基因遗传变异是影响结直肠癌易感性的重要因素之一,并且可导致结直肠癌发病的性别差异。