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背景和目的:原发性肺癌是当今世界严重危害人类健康的恶性肿瘤,进展期肺癌患者5年生存率低,预后不良,临床迫切需要安全高效的早期筛选策略。当前临床上广泛使用的肺癌肿瘤标志物细胞角蛋白19或鳞状细胞癌抗原其总灵敏度仅35%（27%-44%）,寻找特异性好、灵敏度高的肿瘤标志物是临床亟待解决的课题。液体活检是一种安全且相对微创或无创的活检技术,主要检测循环肿瘤细胞、循环肿瘤DNA和外泌体,由于外泌体较其他两者生物性状更稳定、标本形式更丰富且检测丰度更高近年来备受关注。本研究拟从细胞水平和临床肿瘤患者两个角度分别研究人天冬氨酰-（天冬酰胺酰）β-羟化酶（ASPH）在非小细胞肺癌细胞株及上清液外泌体及肺癌肿瘤组织和患者肺泡灌洗液外泌体中的表达情况,比较其在细胞和外泌体间的表达差异,并采用ROC曲线分析ASPH在非小细胞肺癌诊断过程中灵敏度及特异性,初步探究ASPH在外泌体中的表达能否作为非小细胞肺癌诊断的生物标志物及非小细胞肺癌患者支气管肺泡灌洗液外泌体中ASPH表达能否作为一种新的非小细胞肺癌液体活检手段。方法:采用免疫荧光和RT-qPCR检测非小细胞肺癌细胞株A-549、NCI-H1299、NCI-H1650、HCC-827和正常支气管上皮细胞株NL-20中ASPH的m RNA表达差异;然后提取非小细胞肺癌细胞株培养液上清中的外泌体,首先通过流式细胞术检测外泌体表面标志物CD63和CD81来验证外泌体提取成功,然后利用透射电镜观察外泌体的形态、大小及分布;并通过RT-qPCR检测非小细胞肺癌细胞株外泌体中ASPH的表达情况。收集本单位病理科自2015年1月至2019年6月间经病理确诊为非小细胞肺癌手术患者的临床病理资料90例,其中男62例,女28例,年龄45~70岁,中位年龄56岁,根据第7版AJCC癌症分期手册p TNM分期Ⅰ期20例,Ⅱ期40例,Ⅲ期26例,Ⅳ期4例;腺癌46例,鳞癌44例,根据组织学分化程度高分化30例,中分化42例,低分化18例;无淋巴结转移34例,有淋巴结转移56例。同时取配对的距癌旁5cm以上正常组织和同期行手术切除的20例良性肺疾病作为对照组,其中肺结核7例,炎性假瘤6例,错构瘤4例,支气管腺瘤2例,硬化性肺细胞瘤1例。所有肺癌患者均为初诊初治,术前均未行放疗、化疗或靶向药物治疗,均有完整的临床资料和随访资料。所有标本经10%中性福尔马林固定,常规石蜡包埋,4μm厚连续切片,苏木素-伊红（HE）染色。全部石蜡切片均由两名副高级职称以上病理医师复阅诊断。取90例不同组织学类型的非小细胞肺癌患者肿瘤组织及相应的癌旁组织行免疫组织化学检测肿瘤组织中ASPH的表达情况。行手术切除治疗的90例患者均在手术前接受了支气管肺泡灌洗,并选取同期20例行支气管肺泡灌洗术的良性肺疾病患者做对照,收集灌洗液中外泌体,通过RT-qPCR检测非小细胞肺癌患者及良性肺疾病患者支气管肺泡灌洗液外泌体中ASPH的表达水平;另取上述中27例不同组织学类型的非小细胞肺癌患者和15例良性肺疾病患者的肺泡灌洗液同时离心收集细胞制作细胞蜡块,行免疫细胞化学检测ASPH的表达,并确定其结果是否与免疫组化具有一致性,并采用ROC曲线分析ASPH在非小细胞肺癌诊断过程中灵敏度及特异性的差异性。结果:1.与正常支气管细胞NL-20相比,NSCLC细胞系A-549、NCI-H1299、NCI-H1650和HCC-827中ASPH的m RNA表达水平明显升高。2.免疫荧光结果显示ASPH蛋白在NSCLC细胞系中高表达,这与RT-qPCR分析结果一致。3.外泌体表面标志物CD63的阳性率为45.9%,显著高于阴性对照组1.8%（P＜0.01）;表面标志物CD81的阳性率为74.0%,显著高于阴性对照组0.0%（P＜0.01）。4.透射电子显微镜显示细胞培养上清液中的外泌体较丰富,且分布均匀,外泌体的直径约40-150 nm。5.与NL-20相比,非小细胞肺癌细胞系外泌体中ASPH的m RNA表达水平显著增加,尤其是A-549外泌体ASPH的m RNA表达水平增加了10倍以上,HCC-827细胞增加了2.5倍。6.不同组织学类型的非小细胞肺癌患者肿瘤组织免疫组化染色呈细胞质和细胞膜中较深的棕黄色颗粒状着色,表现出高水平的ASPH免疫反应性,而非小细胞肺癌患者癌旁组织以及正常肺组织几乎没有染色或非常微弱着色。7.ASPH在非小细胞肺癌组织、癌旁组织及肺良性疾病中的阳性表达率分别为68.9%、20%和10%,肺癌组织中ASPH的表达水平显著高于癌旁正常肺组织和良性肺疾病组织,差异有统计学意义（P＜0.01）。8.ASPH的表达在肿瘤大小、淋巴结转移及TNM分期不同组别中差异有统计学意义（P＜0.05）,在年龄、性别、吸烟史、组织学分级、组织学类型、分化程度等不同组别中差异无统计学意义（P＞0.05）。9.非小细胞肺癌患者（包括肺癌早期患者）支气管肺泡灌洗液外泌体中ASPH的m RNA表达较高,而非小细胞肺癌患者癌旁组织和正常肺组织ASPH呈低表达。非小细胞肺癌患者BAL中外泌体ASPH的表达水平显著高于癌旁组织非恶性组织和正常肺组织（P＜0.01）。10.非小细胞肺癌患者BAL细胞的免疫细胞化学检测显示:ASPH在非癌患者的正常支气管粘膜上皮细胞和正常肺泡上皮细胞中呈阴性表达或低表达,在不同组织学类型的非小细胞肺癌患者支气管肺泡灌洗液细胞中高表达。此外,非小细胞肺癌的BAL外泌体中ASPH阳性率明显高于BAL细胞中ASPH的阳性率（81.5%VS.59.3%,P＜0.01）。11.ROC曲线分析:ASPH在临界值处所对应的灵敏度及特异性分别为81%,90%。AUC的面积值为0.866,并在95%置信区间（0.768~0.964）内,P＜0.001,差异具有显著统计学意义。结论:1.ASPH在非小细胞肺癌细胞系及非小细胞肺癌细胞系外泌体中均高表达。2.ASPH在不同组织学类型非小细胞肺癌患者组织中均呈高表达。3.ASPH在非小细胞肺癌患者支气管肺泡灌洗液细胞及支气管肺泡灌洗液外泌体中高表达,与非小细胞肺癌组织免疫组化结果高度一致。4.支气管肺泡灌洗液外泌体ASPH检测技术可以提高BAL的敏感性和ASPH在非小细胞肺癌早期诊断中的特异性,支气管肺泡灌洗液外泌体可能为非小细胞肺癌提供新的液体活检方法,且本研究中支气管肺泡灌洗液外泌体分离方法在临床实验室中易于操作。5.与支气管肺泡灌洗液细胞相比,利用支气管肺泡灌洗液外泌体检测拥有更高的ASPH检出率,漏诊率更低。6.ROC曲线显示支气管肺泡灌洗液外泌体ASPH高表达可以区分非小细胞肺癌患者,用于非小细胞肺癌的诊断。