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非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指除酒精和其他肝损伤因素所导致的肝细胞内脂质异常蓄积的一类疾病。目前对于非酒精性脂肪性肝病的发病机制研究还不是很清楚。“二次打击”学说是目前对非酒精性脂肪性肝病发病机制一种广泛认可的学说,即首先由于胰岛素抵抗等因素导致脂质在肝细胞内异常蓄积,其次肝细胞内异常蓄积的脂质导致肝细胞进一步的损害,非酒精性脂肪性肝炎,肝纤维化甚至肝癌的发生。因此,研究非酒精性脂肪性肝病的发病过程中的分子机制对于预防NAFLD疾病谱的进展有着重要意义。Rab蛋白属于小GTP结合蛋白家族中最大的亚家族。Rab蛋白在细胞胞内参与各种膜运输过程。Rab蛋白家族通过特有的分子开关机制,参与囊泡形成,转运,黏附,锚着,融合等过程,实现胞内的物质运输以及膜转运的功能。由于细胞胞内发生脂质异常蓄积过程中会有大量的膜活动,因此不难推断,Rab蛋白可能参与了细胞胞内脂质蓄积的过程并在其中发挥重要的作用。迄今为止,已经有多篇文献报道Rab蛋白参与了多种细胞中脂质蓄积的过程。Rab32作为Rab蛋白中目前唯一与线粒体共定位的Rab蛋白,极有可能参与了胞内的能量代谢过程,目前已有文献报道Rab32在饥饿状态下参与了果蝇中外周脂肪体脂质蓄积的过程,并且能够改变其脂质蓄积的程度。但是,目前对于Rab32在正常状态和能量过剩状态下影响细胞胞内的脂质蓄积程度及其可能的分子机制还未有报道。并且,Rab32蛋白在果蝇以及人类中的氨基酸序列有着显著的种属差异,其在不同种属中的功能有可能完全不同。因此,研究Rab32蛋白在肝细胞中对脂质蓄积的影响及其可能机制有助于我们了解非酒精性脂肪性肝病的发病分子机制,具有重要的意义。目的:研究Rab32蛋白对肝细胞胞内脂质蓄积的影响及其可能的作用机制方法:1.利用e Xact-6xHis蛋白纯化系统鉴定分析Rab32蛋白的相互作用蛋白前期,我们利用profinity e Xact蛋白纯化标签,建立了eXact-6x His蛋白串联亲和纯化系统,并且在真核系统里面验证了e Xact-6x His纯化系统的纯化效率。通过条件优化,使eXact-6xHis对膜蛋白的纯化效率得到显著提高。因此,我们使用e Xact-6x His蛋白纯化系统构建了Hepa1-6plentisEHEGFPRab32细胞系,对细胞中Rab32蛋白进行纯化后,利用SDS-PAGE蛋白凝胶电泳对纯化样品进行分离,并使用硝酸银染色法验证了纯化效果。结果显示,eXact-6x His对Rab32蛋白的纯化效果明显,达到了送测质谱的要求。因此,我们将蛋白纯化样本送布鲁克公司,利用非标定量的方法进行检测,鉴定分析出了Rab32蛋白可能的相互作用蛋白。2.Rab32蛋白在肝细胞脂质蓄积中的作用机制研究在鉴定分析完Rab32蛋白的相互作用蛋白后,我们推断出Rab32蛋白极有可能参与了胞内的能量代谢过程。我们使用GEO数据库对13例胆囊手术伴有非酒精性脂肪性肝病的病人以及13例胆囊手术不伴有非酒精性脂肪性肝病的病人肝组织中Rab32m RNA水平进行统计,并且我们自己收集6例胆囊手术伴有非酒精性脂肪性肝病的病人以及6例胆囊手术不伴有非酒精性脂肪性肝病的病人的肝组织,QPCR显示的结果与GEO数据库统计结果一致。随后,我们以OA:PA=2:1模拟脂肪酸诱导HepG2和L02细胞,建立了非酒精性脂肪性肝病细胞模型。收集细胞后,我们提取细胞总蛋白检测Rab32蛋白在脂质蓄积情况下的表达变化,所得结果与前面结果一致。这说明Rab32蛋白在脂质蓄积过程中表达发生了变化,也提示我们Rab32蛋白在肝细胞脂质蓄积中发挥了作用。随后,我们对Rab32蛋白进行了过表达和干扰,检测了Rab32蛋白在肝细胞脂质蓄积中的作用,并且证明了Rab32蛋白主要通过影响肝细胞胞内脂质水解的过程进而影响胞内脂质蓄积的程度。接着我们使用免疫共沉淀法检测了Rab32蛋白是否和脂质水解的关键酶ATGL存在着相互作用关系,结果显示Rab32是通过间接作用影响ATGL的表达改变,这符合我们质谱结果中没有检测到ATGL蛋白的结果。结论:1).通过e Xact-6xHis蛋白纯化系统对Rab32蛋白进行纯化,并使用非标定量,5次对蛋白样品进针,Decoy评分筛选高可信度差异蛋白,分析出Rab32蛋白可能的相互作用蛋白有Rab38,PHB1以及PHB2。从功能和定位上说明,Rab32极有可能参与了胞内的能量代谢过程。2).GEO数据库,临床样本QPCR显示,非酒精性脂肪性肝病病人肝组织中Rab32m RNA表达水平低于正常对照组。使用HepG2以及L02细胞构建非酒精性脂肪性肝病细胞模型后,Western Blots结果显示蛋白水平上Rab32蛋白在脂肪酸刺激组中蛋白表达水平同样下降。过表达以及干扰Rab32蛋白表达后,在四个脂肪酸浓度梯度检测胞内脂质蓄积水平显示,敲低Rab32蛋白能够引起胞内脂质蓄积水平下降。同时,通过对脂质水解关键酶ATGL和脂质合成关键酶FASN的表达水平进行检测,我们证实Rab32主要通过影响ATGL的表达水平进而影响胞内的脂质蓄积水平的。随后,免疫共沉淀实验显示Rab32是通过间接作用影响ATGL蛋白的表达改变的。因此,我们得出结论:Rab32蛋白能够通过影响ATGL蛋白的表达水平进而通过胞内脂质水解的过程实现对胞内脂质蓄积程度的影响。