研究背景偏头痛作为临床最常见的原发性头痛,具有患病率高的特点,在国内、外人群中分别占15.0%和9.3%。长期的偏头痛不仅严重影响患者身心健康、降低生活质量,而且增加了患中风、冠心病等心脑血管疾病的风险,造成个人、家庭以及社会的巨大负担。然而偏头痛发病机制复杂,无统一定论,目前以三叉神经血管学说为主导,此学说认为在偏头痛发病过程中,三叉神经通路中神经肽类物质起了重要作用,尤其是降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP),其不仅会直接引起偏头痛,而且还可通过介导其他多种化学物质的变化影响偏头痛的发生发展。由此可见三叉神经通路中CGRP介导的内环境变化对于偏头痛具有直接作用。临床中,中西医已有较多的方法用于治疗偏头痛,其中西药CGRP及其受体拮抗剂、五轻色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)受体激动剂是两类治疗偏头痛的主要药物,其镇痛效果较好,但也存在一定副作用。中医也常用于治疗偏头痛,尤其是针灸,具有操作简单、损伤小、副作用轻、易于被患者所接受等优势,在临床上使用广泛。临床研究显示针灸可以明显缓解患者疼痛,延缓其慢性化进程,改善患者生活质量等。关于针刺的具体作用机制研究多在动物身上开展,目前针灸在这方面已做了较多工作,包括从血液流变学、微循环等方面的研究显示针灸可以通过调节血液中CGRP等化学物质的浓度,从而缓解偏头痛,但目前为止鲜有研究从神经科学角度研究相关机制,因此,针灸作用与三叉神经通路中CGRP等变化的相关性仍未知。基于此,本研究提出假说:针刺通过调节三叉神经通路中CGRP介导的相关化学物质变化可能是其缓解偏头痛的作用机制之一。目的及意义探讨针刺干预偏头痛常用头面部腧穴的神经支配及相关神经环路,揭示腧穴从外周至中枢的神经通路/环路与三叉神经通路的相关性,提供选穴依据;观察脑膜的神经环路及神经化学特征,揭示其与外周头面腧穴的神经环路在三叉神经系统中的共同特点及CGRP等阳性神经纤维在脑膜的分布特点;以腧穴及脑膜的共同神经通路/环路为切入点,通过行为学以及脑膜上神经纤维和免疫细胞的组织化学变化,综合探讨针刺干预偏头痛的作用机制,为临床针刺缓解偏头痛提供相应的神经解剖学依据。研究方法第一部分研究:首先将神经示踪剂霍乱毒素亚单位B(cholera toxin subunit B,CTB)注入头面部腧穴“阳白”(GB14)、“四白”(ST2)及“颊车”(ST6)穴区的皮肤和肌肉,通过免疫荧光组织化学染色的方法观察与每个腧穴相关的神经成分的分布,其中包括三叉神经节(trigeminal ganglion,TRG),背根神经节(dorsal root ganglia,DRG),脊髓和脑干,揭示GB14、ST2 及 ST6 相关感觉及运动环路的差异;其次,将CTB和荧光金(fluorogold,FG)分别注入GB14和丘脑腹后内侧核(ventral posteromedial nucleus of thalamus,VPM),3 天后取出脑组织,通过免疫荧光组化的方法揭示腧穴和丘脑相关神经成分在三叉神经脊束核(spinal trigeminal nucleus,Sp5)的分布特点;同时将CTB注入VPM,观察CTB标记的与VPM相关的顺行神经纤维终末在大脑第一躯体感觉皮质(primary somatosensory cortex,S1)的分布特点。第二部分研究:首先通过免疫荧光组织化学的方法观察大鼠硬脑膜中神经纤维及免疫细胞的分布及相互关系,检测的生物化学指标包括CGRP、P物质(substance P,SP)、酩氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)、神经肽 Y(neuropeptide Y,NPY)、降钙素样受体(calcitonin-like receptors,CRLR)、类胰蛋白酶(tryptase)、溶酶体相关膜蛋白 1(lysosomal-associated membrane protein1,LAMP-1)、5-HT等,这些化学物质分别显示CGRP、SP、TH及NPY阳性神经纤维、CRLR阳性CGRP受体、tryptase 阳性肥大细胞(mast cell,MC)等在血管壁等组织和细胞上的分布特点及相互空间关系,揭示脑膜的神经化学特征;其次,将FG示踪于硬脑膜表面,观察脑膜相关的神经成分在TRG、颈上神经节(superior cervical ganglia,SCG)、迷走神经节(vagus ganglion,VAG)、膝状神经节(geniculate ganglion,GG)、翼腭神经节(pterygopalatine ganglion,PG)、Sp5及DRG的分布特点,并同时结合免疫荧光组化的方法,观察阳性标记的神经成分与CGRP、TH阳性神经元的共表达情况,揭示硬脑膜的神经支配及相关神经环路的同时研究脑膜CGRP、TH阳性神经纤维的来源;再次,分别用CTB和FG示踪于GB14与脑膜,7d后取出脑、脊髓、TRG、SCG、VAG等相关组织,主要观察分析与腧穴及脑膜相关神经成分在TRG的共标记情况,揭示腧穴及脑膜在神经环路方面的共同特征及其与三叉神经通路的相关性。第三部分研究:首先,对在呼吸麻醉下的大鼠制造偏头痛模型,正常组注入生理盐水,模型组、针刺组及药物组注入硝酸甘油注射液(nitroglycerin injection,NTG),同时;针刺组予以GB14及ST2电针干预30 min,药物组予以CGRP受体拮抗剂olcegepant尾静脉注射,造模及干预前后所有动物检测头面部机械痛阈,并观察行为学的变化,包括耳红、挠头、抓耳、爬笼、抖身等的次数变化;其次,在动物干预及行为学检测后予以4%多聚甲醛经心脏灌流、固定及取材,取出大鼠硬脑膜,结合免疫荧光组化及共聚焦立体成像的方法对脑膜的神经化学物质的分布及相互关系的动态变化进行观察及检测,检测指标包括CGRP、CRLR、tryptase、LAMP-1、5-HT 等,总结 CGRP 阳性神经纤维、CRLR 阳性CGRP受体、tryptase阳性激活型MC、tryptase/LAMP-1阳性共表达的脱颗粒MC、5-HT阳性细胞在脑膜中的动态变化及交互作用与针刺镇痛效应的相关性。研究结果第一部分实验:首先,通过将头面部腧穴示踪后可见CTB标记的神经成分包括感觉神经元、跨神经节投射的神经纤维轴突终末以及运动神经元。与GB14、ST2 ST6腧穴相关的感觉神经元分布在TRG和上颈段C2-C4的DRG中,并且它们中枢投射的轴突终末则以有序的方式分布于Sp5和颈部脊髓背角,其中在TRG的分布分属于三叉神经第一支(眼支)、第二支(上颌支)和第三支(下颌支)对应的特定区域;在Sp5的分布分别为三叉神经脊束核极间亚核(spinal trigeminal nucleus,internal part,Sp5I)、尾侧亚核(spinal trigeminal nucleus,caudal part,Sp5C)及三叉神经脊束核背内侧核(dorsomedial spinal trigeminal nucleus,DMSp5)。同时,GB14、ST2及ST6相关的运动神经元也以有序的方式分布于面神经核、三叉神经运动核和颈部脊髓前角中,其中面神经核中的标记与三个腧穴的均相关,三叉神经运动核中的与ST2和ST6相关,而脊髓前角的仅与ST6相关。此外,GB14、ST2及ST6三个腧穴穴区局部皮肤组织中存在丰富的CGRP阳性神经纤维,且与GB14、ST2和ST6相关的感觉神经元在TRG中有部分同样显示CGRP及SP阳性表达,部分分布于面神经核的运动神经元表现为CGRP阳性,分布于三叉神经运动核的与ST2及ST6相关的运动神经元同样显示CGRP阳性。其次,通过GB14和上游VPM同时示踪显示CTB标记的神经纤维终末及FG标记的阳性神经元均分布于Sp5的相同区域,揭示在Sp5区具有感觉传导的接续性。此外,CTB在VPM注射后,其投射的神经纤维终末分布于大脑S1的第3-4层,神经元分布于S1的第5-6层。由此可见,针刺干预偏头痛常用GB14、ST2及ST6分别通过三叉神经感觉通路与Sp5建立特定的区域性联系,即为腧穴相关的一级神经通路/环路,从Sp5至S1为其二、三级相关神经通路/环路,均与三叉神经通路密切相关。第二部分实验:首先可见脑膜中存在密集的血管网及神经纤维构成的神经网络,其中CGRP、SP 阳性神经纤维均为感觉神经纤维,TH、NPY表达在交感神经纤维上,其广泛分布于脑膜的各级血管及结缔组织中,尤其是脑膜中动脉周围。神经纤维多沿着血管外壁走行,或缠绕血管壁,或分布于结缔组织中。其中同性质的神经纤维存在广泛共表达(CGRP与SP,TH与NPY阳性神经纤维),而不同性质的神经纤维之间存在相互独立、相互平行及相互缠绕的关系(CGRP及TH阳性神经纤维);通过同时结合脑膜神经示踪显示脑膜中CGRP阳性神经纤维来源于TRG、DRG、VAG等,而以三叉神经系统的TRG为最多;TH阳性神经纤维主要来源于SCG。CGRP受体在脑膜中亦有分布,部分穿行于CGRP阳性神经纤维上,部分与tryptase阳性MC共表达或表达于其膜上。此外,脑膜中还存在大量的免疫细胞,如tryptase阳性的MC、其中部分同时呈现5-HT阳性表达。其次,通过脑膜神经CTB示踪可见CTB标记的阳性神经纤维终末分布于Sp5及脊髓背角,阳性感觉神经元分布于TRG的各个分支所在区,其中以第一二支所在区为多。可见脑膜受三叉神经支配,尤其是其中的第一、二支,脑膜同样通过三叉神经感觉通路与Sp5建立区域性联系。再次,通过GB14及脑膜同时示踪可见与两者相关的感觉神经元均分布于TRG第一支所在区域,且部分具有共表达的特点,由此可见。GB14及脑膜在神经环路上具有共同点,为针刺干预及确定检测部位提供依据。第三部分实验:首先行为学表现方面,硝酸甘油注射液注射造模后,较空白组相比,模型组大鼠耳朵明显发红,抓耳、挠头、爬笼、抖身次数明显增多(P<0.05);而与模型组相比,针刺及药物CGRP受体拮抗剂注射干预后大鼠抓耳、挠头、爬笼、抖身等次数明显减少(尸<0.05)。在头面部机械痛阈方面,模型组较空白组头面部机械痛阈的阈值显著降低(尸<0.05),针刺及CGRP受体拮抗剂干预组较模型组的痛阂阈值又有显著升高(尸<0.05)。在相应的生物化学物质变化中,单位面积内(630 μm x 630 μm)的MC数量,较空白组相比,模型组大鼠脑膜中tryptase阳性激活型MC、tryptase/LAMP-1阳性共表达的脱颗粒MC的数量均较空白组明显增多(尸<0.05),而较模型组相比,针刺及CGRP受体拮抗剂组大鼠脑膜中tryptase阳性激活型MC及tryptase/LAMP-1阳性共表达的脱颗粒MC的数量均明显减少(尸<0.05),其中针刺与药物组相比无明显差异(尸>0.05);单位面积(630 μm x 630 μm)中CGRP阳性神经纤维的长度,较空白组相比,模型组CGRP神经纤维的分布长度有所增加,针刺及药物干预组较模型组又有所减少,其有变化趋势,但是各组间比较无明显统计学差异(尸>0.05);CGRP受体的分布,模型组大鼠单位面积的脑膜中(630 μmx 630 μm)CRLR 阳性CGRP受体及其表达在tryptase阳性激活型MC上的数量有所增加(P<0.05),针刺干预后CRLR阳性CGRP受体表达在tryptase阳性激活型MC上的数量明显下降(尸<0.05),CGRP受体拮抗剂干预后CRLR阳性CGRP受体及其表达在tryptase阳性激活型MC上的细胞数量明显减少(P<0.05),针刺与药物组相比CRLR阳性CGRP受体表达在tryptase阳性激活型MC上的细胞数量无明显差异(尸>0.05);此外,5-HT阳性细胞的数量变化,模型组较空白对照组的单位面积内(630 μmx 630 μm)5-HT分布数量有所增加,与模型组相比,针刺组tryptase/5-HT共同标记的细胞数量明显下降(P<0.05),药物组5-HT阳性细胞及tryptase/5-HT共同标记的细胞数量均明显减少(尸<0.05),针刺与药物组相比tryptase/5-HT共同标记的细胞数量无明显差异(尸>0.05)。结论通过CTB及FG神经示踪技术从外周到中枢揭示GB14、ST2及ST6三个腧穴通过三叉神经感觉神经通路与Sp5建立区域性联系,三个腧穴穴区局部组织中存在丰富的CGRP阳性神经纤维,且部分分布于TRG的与其相关的神经元同样呈现为CGRP阳性表达,提示针刺头面部腧穴可能通过CGRP起作用:偏头痛发病部位脑膜同样通过三叉神经感觉神经通路与Sp5建立联系,且脑膜中CGRP阳性神经纤维主要来源于TRG;脑膜主要受三叉神经第一、二支支配,与头面部腧穴具有共同的神经通路/环路;针刺可缓解偏头痛模型大鼠的行为学表现及降低痛阈,显示针刺在改善偏头痛症状上具有较好的效应,起源于TRG的CGRP阳性神经元发出的神经纤维在脑膜可能通过参与多种化学物质的合成及释放对维持脑膜内稳态及缓解偏头痛起到关键的作用,即针刺镇痛可能与三叉神经通路CGRP介导的化学物质变化具有密切相关性。