论文部分内容阅读
糖尿病视网膜病变是糖尿病最常见且最严重的并发症之一,也是成年人失明的重要原因之一,随着人们生活水平的提高,及胰岛素替代治疗的广泛应用,其发病率逐年增高。糖尿病视网膜病变分为非增殖型病变和增殖型病变两种,后者以新生血管形成为主要病理特点,易导致玻璃体出血、增殖性视网膜脱离等严重并发症,是造成严重视功能损害的主要原因。新生血管的生长受血管内皮生长因子(VEGF)的调节,新生血管生成过程中的关键环节是内皮细胞的增殖和迁移。VEGF是一种血管内皮细胞特异性的分裂原,能诱导血管内皮细胞增殖、促进新生血管形成。在糖尿病视网膜病变患者眼内VEGF含量明显上调,且其上调程度与视网膜血管出血、渗出等病理过程相关。VEGF的过度表达为糖尿病视网膜病变发生的重要机制之一。因此,抑制VEGF的表达成为临床上糖尿病视网膜病变治疗的重要思路。 微小核糖核酸(MicroRNA,miRNAs)是近年来在真核生物中发现的一类内源性的并具有调控功能的非编码RNA,miRNAs可通过序列特异性的方式与特定靶基因的3UTR相互作用从而调节靶基因的蛋白表达。miRNAs的功能十分广泛,具有高度的保守性、时序性和组织特异性,对细胞的增殖、凋亡、分化、生长发育、胰岛素分泌、肿瘤发生、器官形成、造血过程、病毒等微生物感染防御等均具有非常重要的调节作用。研究表明,某些miRNA具有调节新生血管形成的作用,其中miR-126是目前报道的与血管内皮细胞及血管功能密切相关的一种miRNA,也是体内对维持血管内皮细胞和血管完整性至关重要的一种血管生成信号调节因子。据报道,miR-126可负性调控VEGF等血管生长因子,并抑制新生血管的生成。在多种肿瘤细胞中,miR-126的表达均较正常细胞降低,因此miR-126曾被视为一种抑制细胞生长的因素,且作用于胰岛素受体底物-1(insulin receptor substrate-1,IRS-1)。IRS-1在胰岛素的信号转导及糖尿病的发生发展中起着至关重要的作用。有报道视网膜表达大量的IRS-1和PI3K,且胰岛素通过IRS-1/PI3K/AKT通路和RAS/MAPK通路可诱导小鼠主动脉平滑肌细胞内VEGF mRNA的转录和VEGF的表达。胰岛素对血管内皮细胞VEGF表达的上调可能是通过激活PI3K/AKT通路实现的,且据KEGG通路数据库的预测,VEGF位于IRS-1/ PI3K/AKT通路的下游。因此,在糖尿病视网膜病变中,miR-126很可能作用于IRS-1且通过IRS-1/PI3K/AKT通路参与视网膜新生血管形成过程的调节。 目的:检测miR-126及IRS-1在糖尿病模型大鼠的视网膜血管内皮细胞(endothelial cells,EC)和周细胞(retinal pericytes,RP)中的表达水平,寻找并证实IRS-1为miR-126的靶基因。探讨过表达或抑制miR-126对糖尿病模型鼠的EC细胞和RP细胞中IRS-1及VEGF、PI3K、AKT等通路蛋白表达水平的影响;探讨过表达或抑制miR-126对糖尿病模型鼠的EC细胞和RP细胞增殖及侵袭能力的影响。验证miR-126对糖尿病模型鼠EC细胞和RP细胞中IRS-1及VEGF、PI3K、AKT等蛋白表达水平的抑制作用以及对EC细胞和RP细胞增殖及侵袭能力的抑制作用是否是通过调控IRS-1的表达而实现的。为miR-126成为一种潜在的以IRS-1为靶点治疗糖尿病视网膜病变的新药提供理论依据。 方法:通过real-time PCR检测miR-126及IRS-1在糖尿病模型鼠EC细胞和RP细胞中的mRNA表达水平。通过Western blot检测IRS-1的蛋白表达水平。通过向糖尿病模型鼠EC细胞和RP细胞中转染人工合成的miR-126类似物或miR-126抑制剂来过表达miR-126或抑制内源性miR-126的表达,并通过real-timePCR检测转染后细胞中miR-126的mRNA水平,以验证miR-126类似物及miR-126抑制剂调节细胞中miR-126表达水平的有效性和效率。用生物信息学检索软件TrgetScan分析预测miR-126的靶基因。采用双荧光素酶报告基因检测系统检测miR-126对IRS-1的调控作用。先将含有预测的miR-126结合位点的IRS-1基因3UTR DNA片段克隆入pGL-3-promotor质粒中,构建报告基因质粒。然后将含有野生型或突变型IRS-13UTR的荧光素酶报告载体质粒(pMIR-REPORT-IRS-1 wt和pMIR-REPORT-IRS-1 mut)与miR-126类似物或其对照共转染EC细胞。转染48小时后,检测各组细胞的荧光素酶活性。同时用Western blot的方法检测转染了miR-126类似物或miR-126抑制剂后,糖尿病模型鼠EC细胞及RP细胞中IRS-1的蛋白表达水平。用MTT法检测转染了miR-126类似物或miR-126抑制剂后,糖尿病模型鼠EC细胞及RP细胞的增殖率。用Transwell小室检测转染了miR-126类似物或miR-126抑制剂后,糖尿病模型鼠EC细胞及RP细胞的侵袭能力。通过Western blot的方法检测过表达或抑制miR-126表达时,糖尿病模型鼠EC细胞中PI3K/AKT通路相关分子PI3K、AKT以及VEGF的蛋白表达水平。最后通过siRNA干扰糖尿病模型鼠EC细胞的IRS-1基因表达,并用Western blot的方法检测IRS-1基因沉默状态下,抑制miR-126内源性表达后,视网膜EC细胞中PI3K、AKT以及VEGF等蛋白的表达水平,并分别用MTT法和Transwell侵袭实验检测上述条件下糖尿病模型鼠EC细胞和RP细胞的增殖和侵袭能力。 结果:real-time PCR的检测结果显示糖尿病模型鼠的EC细胞和RP细胞中miR-126表达水平较正常对照降低。转染miR-126类似物或miR-126抑制剂可有效地在糖尿病模型鼠EC细胞和RP细胞中过表达miR-126或抑制其内源性miR-126的表达水平。生物信息学预测IRS-1基因为糖尿病模型EC细胞和RP细胞中miR-126的靶基因。在糖尿病模型鼠的EC细胞和RP细胞中,IRS-1的mRNA及蛋白表达水平均较正常对照升高。通过共转染miR-126类似物或抑制剂与含有IRS-13UTR的荧光素酶报告载体并采用双荧光素酶报告基因检测,以及通过转染miR-126类似物或抑制物来过表达或抑制miR-126表达,Western blot的方法检测IRS-1的蛋白表达水平,发现过表达miR-126可显著下调IRS-1的表达水平,而抑制miR-126的表达可上调IRS-1的表达水平。 EC细胞和RP细胞分别转染了miR-126类似物或miR-126抑制剂及其对照后,用MTT的方法检测了细胞的增殖率,结果显示,过表达miR-126使EC细胞和RP细胞的增殖率较对照组降低,而抑制miR-126则使EC细胞和RP细胞的增殖率较对照组增加,提示miR-126可抑制糖尿病模型鼠EC细胞和RP细胞的增殖能力。同时,Transwell侵袭实验检测转染后EC细胞和RP细胞的侵袭能力,结果显示,通过miR-126类似物转染过表达miR-126,使侵袭细胞的数量较对照组显著减少,而经miR-126抑制剂转染抑制miR-126内源性表达后,侵袭细胞的数量较对照组显著增多,提示miR-126可抑制糖尿病模型鼠EC细胞和RP细胞的侵袭能力。 进而,通过Western blot的方法检测了通过转染miR-126类似物或miR-126抑制剂过表达或抑制miR-126表达后,PI3K/AKT通路相关分子PI3K、AKT以及VEGF的蛋白表达水平。结果显示,过表达miR-126可显著下调PI3K,AKT以及VEGF蛋白的表达,而抑制miR-126则可显著上调PI3K,AKT以及VEGF蛋白的表达。为了证实miR-126对PI3K、AKT及VEGF等PI3K/AKT通路蛋白表达水平的调节及对视网膜EC细胞和RP细胞增殖及侵袭能力的抑制作用是通过调控IRS-1基因而实现的,用siRNA干扰IRS-1的表达,将IRS-1-siRNA与miR-126抑制剂或其对照共转染糖尿病模型鼠EC细胞,并用Western blot的方法检测共转染后细胞的PI3K、AKT及VEGF等蛋白表达水平,用MTT法及Transwell侵袭实验分别检测共转染后细胞的增殖能力和侵袭能力。结果表明,IRS-1被干扰后,miR-126抑制剂对糖尿病模型鼠EC细胞的PI3K、AKT及VEGF等蛋白表达水平以及对视网膜EC细胞增殖能力和侵袭能力的作用均被削弱。 结论:本课题发现了miR-126在糖尿病模型鼠视网膜毛细血管EC细胞和RP细胞中表达下降。miR-126在糖尿病模型鼠EC细胞和RP细胞中的靶基因为IRS-1。过表达miR-126可通过下调其靶基因IRS-1的表达水平而下调VEGF、PI3K、AKT等通路蛋白的表达水平,且抑制视网膜EC细胞和RP细胞的增殖能力及侵袭能力。通过siRNA干扰IRS-1的表达,可抵消miR-126抑制剂对上述通路蛋白表达的EC细胞增殖及侵袭能力的作用。我们的结果表明,IRS-1是miR-126的靶基因,miR-126通过调控IRS-1参与糖尿病视网膜病变的病理生理过程。本研究的结果有助于我们进一步理解糖尿病视网膜病变的发病机制,为miR-126成为治疗糖尿病视网膜病变的一种潜在的新药提供了理论依据。