论文部分内容阅读
血脑屏障(Blood-brain barrier, BBB)，是指位于中枢神经系统与外周血液循环之间由多种细胞与非细胞成分共同构成的血管组织结构，主要功能由脑微血管内皮细胞承载，其他种类细胞（如星形胶质细胞、周细胞、细胞外基质、小胶质细胞以及神经元等）围绕脑微血管周围，共同辅助内皮细胞起作用。其主要的功能为限制物质进出中枢神经系统，保持中枢神经系统内部环境的稳定性。血脑屏障通透性功能的破坏在几乎所有的中枢神经系统疾病中有所发生，这会导致大量外周血液中的成分进入中枢神经系统，进一步加剧疾病病程恶化。同时，研究如何可控的增加血脑屏障通透性，对于药物到达中枢神经系统，治疗中枢神经系统疾病具有重要意义。因此，寻找新型调节血脑屏障通透性的靶点具有重要意义。 研究目的: 我们课题组在大脑皮质中发现一种新型蛋白swiprosin-1，其主要集中表达于脑微血管内皮细胞中。Swiprosin-1是2004年首次报道发现的小分子量蛋白，目前关于该蛋白的研究主要集中见于B淋巴细胞、T淋巴细胞等免疫细胞调节方面，该蛋白在其他方面作用知之甚少。脑微血管内皮细胞中过表达swiprosin-1后发现紧密连接蛋白ZO-1表达明显减少，由于脑微血管内皮细胞是构成血脑屏障的结构基础，紧密连接蛋白对内皮细胞通透性具有重要调节作用。据此，我们推测swiprosin-1在血脑屏障通透性调节过程中起到作用。本课题旨在研究swiprosin-1在血脑屏障通透性调节过程中如何发挥作用，明确其在血脑屏障通透性调节过程中的机制，为进一步寻找调节血脑屏障通透性的新靶点奠定基础。 内容与方法: 一、Swiprosin-1在脑皮质中的表达定位及其在不同动物模型中的表达差异 1.利用免疫印迹技术观察swiprosin-1在正常小鼠全身不同组织器官中的表达含量; 2.利用免疫组织化学技术检测swiprosin-1在大脑中表达分布情况; 3.体外培养大鼠脑微血管内皮细胞(BMEC)，利用免疫细胞化学技术检测swiprosin-1在其中表达分布; 4.制作三种增加血脑屏障通透性的动物模型:分别是大脑中动脉栓塞(MCAO)、LPS处理诱发全身性免疫反应、冷冻损伤，尾静脉注射伊文思蓝，体外直接观察与荧光下检测明确其血脑屏障功能破坏; 5.免疫荧光检测三种动物模型中claudin-5、VE-cadherin、caveolin-1表达差异; 6.免疫印迹检测三种血脑屏障通透性增加的动物模型中swiprosin-1表达变化; 7.免疫印迹检测BMEC缺糖缺氧(OGD)后swiprosin-1表达。 二、Swiprosin-1高表达与低表达对血脑屏障通透性的影响 1.构建swiprosin-1敲除小鼠，尾静脉注射伊文思蓝后，与野生型小鼠相比，两组大脑中伊文思蓝渗出差异; 2.构建swiprosin-1基因过表达小鼠，尾静脉注射伊文思蓝后，与野生型小鼠相比，荧光定性及定量比较两组大脑中伊文思蓝渗出差异; 3.对swiprosin-1基因敲除小鼠施行MCAO手术，术后22h尾静脉注射伊文思蓝，荧光定性和定量比较两组大脑中伊文思蓝渗出。 三、Swiprosin-1对血脑屏障通透性调节作用的机制研究 1.免疫组织荧光染色定性比较swiprosin-1过表达小鼠与野生型小鼠在生理状况下紧密连接蛋白occludin、ZO-1分布; 2.免疫印迹定量比较swiprosin-1过表达小鼠与野生型小鼠在生理状况下大脑皮质中紧密连接蛋白occludin、ZO-1及claudin-5表达; 3.免疫组织荧光染色定性比较swiprosin-1敲除鼠MCAO后梗死区与非梗死区紧密连接蛋白occludin、ZO-1分布表达，及伊文思蓝浸润区域; 4.免疫印迹定量比较swiprosin-1敲除鼠MCAO后梗死区与非梗死区紧密连接蛋白occludin、ZO-1表达; 5.免疫印迹检测Swiprosin-1过表达小鼠大脑皮质中ROCK-1蛋白表达; 6.免疫印迹检测BMEC中过表达swiprosin-1后紧密连接蛋白ZO-1表达，以及给予ROCK-1抑制剂Y27632后ZO-1蛋白表达变化; 7.免疫印迹检测Swiprosin-1敲除小鼠MCAO后，大脑皮质梗死区与对照区域ROCK-1表达; 8.免疫印迹检测干扰swiprosin-1的BMEC中，OGD处理6h后ZO-1表达; 9.免疫印迹检测OGD处理BMEC6h后，连接蛋白ZO-1、occludin表达变化，及给予Y27632后连接蛋白ZO-1及occludin表达变化; 10.免疫共沉淀检测野生型小鼠脑皮质中swiprosin-1与ZO-1相互作用关系。 四、体外实验探究swiprosin-1调节BMEC中紧密连接蛋白及骨架蛋白的作用 1.免疫荧光检测BMEC中过表达swiprosin-1后occludin、ZO-1分布改变，及与给药Y27632后分布改变; 2.免疫荧光检测BMEC中过表达swiprosin-1后claudin-5分布改变，及与给药Y27632后分布改变; 3.免疫荧光检测BMEC中过表达swiprosin-1后细胞骨架蛋白F-actin分布改变，及与给药Y27632后分布改变; 4.免疫荧光检测BMEC中OGD处理6h后ZO-1分布改变，及与给药Y27632后ZO-1分布改变; 5.免疫荧光检测BMEC中OGD处理6h后骨架蛋白F-actin分布，及与给药Y27632后F-actin分布改变。 五、Swiprosin-1对BMEC其他内皮细胞相关功能的影响 1.免疫荧光观察BMEC中干扰swiprosin-1，OGD6h后细胞形态; 2.BMEC过表达swiprosin-1后，细胞形态观察及迁移活性定量检测; 3.BMEC过表达swiprosin-1后，细胞小管新生能力定量检测。 结果: 一、成功制作三种病理性增加血脑屏障通透性的动物模型并检测swiprosin-1表达 1.Swiprosin-1在全身多组织器官中存在表达，其中大脑、小脑、延髓、间脑等中枢神经系统组织均表达; 2.Swiprosin-1主要分布于大脑皮质中的脑血管中; 3.原代BMEC表达swiprosin-1，且主要分布于胞质中; 4.成功制作了MCAO、LPS处理诱发全身性免疫反应、冷冻损伤三种增加血脑屏障通透性动物模型。模型动物尾静脉注射伊文思蓝后，整个脑组织可见明显蓝色浸润，切片荧光下可以检测到红色荧光; 5.三种动物模型中claudin-5、VE-cadherin表达均下调，caveolin-1表达上调; 6.三种血脑屏障通透性增加的动物模型中，大脑皮质swiprosin-1表达上调; 7.BMEC中OGD处理后swiprosin-1表达量随着缺氧时间的延长而增加，1h后显著上调，4h时表达最高，至6h达到稳定。 二、Swiprosin-1影响血脑屏障通透性 1.与野生型小鼠相比，swiprosin-1敲除鼠生理状态下血脑屏障通透性无明显变化; 2.与野生型小鼠相比，swiprosin-1过表达鼠生理状态下血脑屏障通透性明显增加; 3.与野生型小鼠相比，swiprosin-1敲除鼠MCAO术后伊文思蓝渗出明显减少。 三、Swiprosin-1通过紧密连接蛋白调节血脑屏障通透性 1.Swiprosin-1过表达小鼠大脑皮质血管中紧密连接蛋白occludin、ZO-1不连续分布; 2.Swiprosin-1过表达小鼠大脑皮质中occludin、ZO-1表达减少，claudin-5表达不变; 3.与野生型小鼠相比，swiprosin-1敲除鼠MCAO术后脑梗死区域occludin、ZO-1分布更为完整，伊文思蓝集中于血管内分布，脑实质中浸润较少; 4.与野生型小鼠相比，swiprosin-1敲除鼠MCAO术后脑梗死区域occludin、ZO-1表达降低程度减轻; 5.与野生型小鼠相比，Swiprosin-1过表达鼠大脑中ROCK-1含量显著增高; 6.细胞水平，过表达swiprosin-1后，BMEC中ZO-1表达显著降低;给予Y27632，ZO-1表达显著增加; 7.Swiprosin-1野生型鼠MCAO术后，大脑皮质梗死区域ROCK-1表达显著增加;在swiprosin-1敲除型鼠中，两者无显著差异; 8.与空白病毒组相比，BMEC干扰swiprosin-1后，OGD处理6h时，ZO-1表达显著增加; 9.BMEC中，OGD损伤6h后occludin、ZO-1表达显著下调，给予Y27632可抑制OGD损伤造成的occludin、ZO-1表达下调; 10.Swiprosin-1野生型鼠脑皮质中swiprosin-1与ZO-1存在蛋白蛋白相互作用。 四、Swiprosin-1影响BMEC中紧密连接蛋白及骨架蛋白分布 1.BMEC中过表达swiprosin-1后，紧密连接蛋白occludin、ZO-1分布连续性减弱，Y27632可抑制occludin、ZO-1分布连续性减弱; 2.BMEC中过表达swiprosin-1后，紧密连接蛋白claudin-5分布无明显变化; 3.BMEC中过表达swiprosin-1后，细胞骨架蛋白F-actin分布趋向胞膜，Y27632可抑制F-actin分布趋向胞膜; 4.BMEC中OGD损伤6h，后紧密连接蛋白ZO-1分布连续性破坏，Y27632可抑制ZO-1分布连续性破坏; 5.BMEC中OGD损伤6h后，细胞骨架蛋白F-actin分布趋向胞膜，Y27632可抑制F-actin分布趋向胞膜。 五、Swiprosin-1调节内皮细胞功能 1.BMEC中OGD损伤6h后，细胞形态杂乱，细胞皱缩明显。Y27632可减弱此种刺激下细胞形态的改变; 2.BMEC中OGD损伤6h后，细胞形态改变明显，干扰swiprosin-1后可以减弱细胞形态改变; 3.BMEC中过表达swiprosin-1后，细胞胞体伸出伪足，提示迁移能力增强; 4.BMEC中过表达swipro sin-1后，细胞迁移能力增强; 5.BMEC中过表达swiprosin-1后，小管新生能力无明显变化。 结论: 1.Swiprosin-1是影响血脑屏障通透性的一个重要蛋白; 2.Swiprosin-1主要通过紧密连接蛋白occludin、ZO-1及细胞骨架蛋白F-actin调节血脑屏障通透性; 3.ROCK-1参与swiprosin-1调节血脑屏障通透性。