研究背景鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma NPC)是我国南方地区高发的一种恶性肿瘤(发病率每年在10-150/1001000),也是头颈部常见的恶性肿瘤之一,治疗上以放疗或辅助诱导化疗加放疗为主,但放化疗导致的局部及全身后遗症严重影响了患者的生存质量。并且,由于鼻咽癌的发病部位较为隐蔽,首诊时多数患者已经伴有淋巴结侵袭或和远处转移,因此,同步放化疗成为局部晚期鼻咽癌患者治疗的标准方式。但有报道化疗耐药占到恶性肿瘤约75%左右,成为鼻咽癌治疗失败,出现复发、转移、影响总体生存率的因素之一。目前,肿瘤多药耐药的机制还不清楚,如何逆转耐药提高治疗效果成为鼻咽癌治疗领域亟待解决的问题。肿瘤细胞的多药耐药性(multidrug resistance MDR)是指细胞对结构和功能均不同的化疗药物产生的耐药性,分为原发性和获得性耐药,后者较为常见。研究MDR的分子机制,对于提高鼻咽癌患者的生存率,减少复发及转移极其重要。一些研究表明,端粒长度/端粒酶活性参与肿瘤MDR。我们课题组曾较为系统探讨了端粒酶在鼻咽癌发病中的作用,发现端粒酶在鼻咽癌细胞及鼻咽癌CD133+干细胞中高表达,靶向降低端粒酶活性可以明显抑制鼻咽癌细胞增殖及迁移。PinXl基因是近年在人和酵母菌细胞中发现的一个能与端粒/端粒酶相互作用的保守核仁蛋白,是端粒酶结合蛋白pin2/TRF1相互作用的一种结合蛋白,并且是唯一能直接与端粒酶结合的一种端粒结合蛋白,高表达PinX1的C-端片段能显著抑制细胞端粒酶活性,缩短端粒并抑制端粒酶阳性肿瘤细胞在体内外生长,被有些学者认为是一种内源性的端粒酶抑制剂,我们的前期研究也证实了PinX1能降低鼻咽癌细胞株的端粒酶活性,并促进该肿瘤细胞凋亡的产生。在一系列前期研究工作的基础上,本研究拟观察PinXl基因在鼻咽癌细胞化疗增敏、逆转化疗耐药中的作用,并进一步探讨端粒酶、抗凋亡因子Bc12及耐药相关基因LRP在这一过程中的调控作用。研究目的观察PinX1基因联合顺铂对人鼻咽癌细胞生物学特性的影响,为基因联合化疗减低鼻咽癌化疗抵抗提供理论依据；探讨端粒酶活性改变、抗凋亡基因Bcl-2及肺耐药相关基因LRP对在上述过程的调节作用。研究内容和方法1、重组慢病毒的构建及鉴定将含PinX1的质粒连接到慢病毒穿梭载体上,并经双酶切及测序鉴定确认,与另外两种辅助质粒共转染293T细胞,收集并浓缩重组病毒液,用浓度梯度法计算病毒滴度。2、慢病毒感染鼻咽癌细胞、检测感染前后PinX1的变化分别将慢病毒Lenti-PinXl和对照组慢病毒Lenti-Crtl感染过的鼻咽癌细胞命名为Lenti-PinX1-5-8F、Lenti-Crtl-5-8F细胞。并用荧光定量PCR检测Lenti-PinXl-5-8F、Lenti-Crtl-5-8F和5-8F细胞中基因mRNA的表达,Western blotting检测PinXl蛋白的表达。3、PinX1联合顺铂对鼻咽癌细胞株生物学特性的影响1)用MTT法检测不同处理组鼻咽癌细胞株的体外增殖能力对感染前后的鼻咽癌细胞5-8F和Lenti-PinX1-5-8F加入不同浓度顺铂处理后,酶标仪测570nm处的吸光度即OD(570)值,每组设置5个复孔,取各复孔的平均值为各组结果。然后,计算生长抑制率,绘制生长抑制曲线,并据Q=E(A+B)/(EA+EB-EA*EB)计算PinX1与化疗药间的相互作用。2) Hoechst33258染色对细胞的凋亡进行形态学观察分别将Lenti-PinX1-5-8F和5-8F以1×104/ml、500ul/孔接种到24孔板中.培养12h待细胞贴壁后,PBS洗细胞两次,按实验分组分别加入500u1全培稀释的顺铂(16ug/ml)或完全培养基,继续置于37℃,5%CO2培养箱培养48h后,4%多聚甲醛室温固定细胞、1ug/ml的Hoechst33258染色,荧光显微镜下观察细胞形态变化。3)流式细胞仪检测细胞周期收集对数生长期的Lenti-PinX1-5-8F和5-8F细胞,PBS洗涤、重悬,调整细胞浓度为1×106/ml,取1ml细胞悬液；1000rpm离心5min,弃上清；加入4℃预冷70%乙醇固定,经PBS洗涤,加入100ul RnaseA37℃水浴30min；避光加入400ulPI染液4℃避光染色至少30min；流式细胞仪上机检测4) Transwell小室检测不同处理后鼻咽癌细胞的迁移能力将Lenti-PinX1-5-8F和5-8F细胞接种到24孔板中,待细胞贴壁后分别给予全培稀释的16ug/ml顺铂或全培继续培养48小时,PBS洗涤细胞,胰酶消化后用不含血清的基础培养基稀释到适当的浓度种到上室内,下室事先加入含20%胎牛血清的全培,37℃,5%CO2培养12小时,将小室置于4%多聚甲醛中固定20min,用棉签擦去上室内细胞,置于1%o结晶紫染色20-30min,清水漂洗至少3次,吹干后用高倍显微镜(400×)随机取上、下、左、右、中5个视野对细胞进行计数。5)划痕实验检测鼻咽癌细胞的愈合能力将Lenti-PinX1-5-8F和5-8F接种到6孔板中,待细胞融合度达80%左右时,用200u1的枪头在每孔中垂直划“+”,并用PBS洗涤脱落细胞,分别加入无血清培养基稀释的16ug/ml的顺铂或无血清培养基继续培养,分别在划痕后Oh、12h、24h、36h时观察并拍照,计算愈合率。4、过表达PinX1基因对鼻咽癌细胞中端粒酶活性、Bcl-2和LRP表达的影响收集对数生长期的Lenti-PinX1-5-8F、Lenti-Ctrl-5-8F和5-8F细胞,采用Stretch PCR法检测端粒酶相对活性,荧光定量PCR和Western blotting检测Bcl-2和LRP表达情况,进一步了解PinX1基因对鼻咽癌细胞化疗增敏的分子机制。5、统计学分析采用SPSS13.0软件处理包进行数据处理分析,参数比较先进行方差齐性检测,若方差不齐,用基于方差不齐的近似F检验的Welch法。荧光定量PCR、 Western Blotting、端粒酶活性检测、小室实验及流式测细胞周期均采用One-Way ANOVA方差分析,方差齐的用LSD法进行多重比较,方差不齐的用Dunnett’s T3法进行多重比较。细胞增殖实验(MTT)和划痕实验均采用析因设计的方差分析。P<0.05具有统计学意义,P<0.01具有显著统计学意义。研究结果1、重组慢病毒的构建与鉴定分别用双酶切及测序鉴定了重组载体的正确,成功获取了病毒液,病毒滴度为1.3×107IU/ml。2、重组慢病毒对鼻咽癌细胞的感染及感染前后PinX1的表达变化慢病毒Lenti-PinX1和对照组慢病毒Lenti-Crtl感染鼻咽癌细胞48h时均可观察到绿色荧光表达,对照组慢病毒Lenti-Crtl感染组荧光相对较强、较多,随着时间延长,荧光量均增多、增强,当感染后96h时荧光表达最多,未感染的细胞始终看不到荧光表达；qRT-PCR和Western blotting均显示Lenti-PinX1-5-8F细胞中PinX1基因较Lenti-Ctrl-5-8F和5-8F细胞中表达增多。3. PinX1基因联合顺铂对鼻咽癌细胞株生物学特性的影响MTT检测显示PinX1、顺铂单用均能不同程度的抑制鼻咽癌细胞的增殖,但两者联合的增殖抑制能力最为明显,当PinX1与8-32ug/ml浓度的顺铂联合时均出现协同作用,尤其在16ug/ml浓度时,协同作用最大。可见,PinX1可以增加鼻咽癌细胞对顺铂的敏感性；Hoechst33258染色进一步从形态学方面说明PinX1和16ug/ml的顺铂联合应用时核固缩、核碎裂等凋亡细胞更为明显；流式细胞仪对细胞周期进行检测,显示PinXl与16ug/ml的顺铂联合能更明显的将细胞周期阻止在G0/G1期,减少细胞的分裂增殖能力；小室试验和划痕试验也证实PinXl与顺铂的联合能显著抑制细胞的迁移和愈合能力。4、PinX1基因对鼻咽癌细胞中端粒酶活性、抗凋亡基因Bcl-2和肺耐药相关基因LRP的影响Stretch PCR对端粒酶相对活性进行检测,发现Lenti-PinX1-5-8F细胞中端粒酶相对活性明显低于Lenti-Ctrl-5-8F和5-8F细胞；qRT-PCR和Western blotting检测结果显示,Lenti-PinX1-5-8F中Bcl-2、LRP低于Lenti-Ctrl-5-8F和5-8F细胞。结论1、PinX1基因联合顺铂能增加对鼻咽癌5-8F细胞的化疗敏感性,尤其是PinX1基因与16ug/ml的顺铂联合应用时协同作用更强,说明联合应用在增强化疗疗效的同时,还可以减少顺铂的用药剂量,这对降低化疗药的全身毒副作用有意义。2、PinXl基因增加顺铂化疗敏感性、逆转耐药作用有可能是通过下调鼻咽癌细胞端粒酶活性、抑制Bcl-2和LRP而实现的。