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目的:胆汁淤积性肝病是由各种原因引起的胆汁不能正常流入十二指肠而进入血液的病理状态,如果病程超过6个月,则成为慢性胆汁淤积,后期会引起门管区纤维化,甚至胆汁性肝硬化的发生[1]。胆汁淤积性肝病主要指原发性胆汁性胆管炎（Primary Biliary Cholangitis,PBC）和原发性硬化性胆管炎（Primary Sclerosing Cholangitis,PSC）,尽管熊去氧胆酸可作为临床治疗的一线药物,但约有33%的PBC及PSC患者存在疾病进展风险,仍有较大风险转变为肝硬化甚至肝癌[2-4]。因此,阻止肝纤维化的进展至关重要。肝纤维化（Hepatic Fibrosis,HF）是机体针对各种原因导致的的慢性肝损伤后的一种修复反应[5],表现为炎性细胞募集,肌成纤维细胞（Myofibroblasts,MF）的激活和再生,细胞外基质（Extracellular Matrix,ECM）成分尤其是胶原等的过度形成和沉积[6]。有研究报道,不论是实质性肝损伤,还是淤胆性肝损伤,ECM的主要来源均为活化的肝星状细胞（HSCs,Hepatic Stellate Cells）[7]。在正常肝脏中,HSCs保持非增殖、静止状态。当出现肝损伤后,HSCs被激活,从储存维生素A的细胞转化为MF,后者具有增殖、收缩、炎症和趋化作用[8]。如果肝损伤因素持续存在,活化的HSCs在ECM中产生和沉积越来越多的I型、III型胶原蛋白及纤连蛋白（Fibronectin,FN）[9]。因此,研究者们普遍认同,HSCs是HF发生发展的关键细胞[10,11],HSCs的活化也被认为是HF发生的关键环节[12]。转化生长因子（Transforming Growth Factor-β,TGF-β）是一种有效的促进纤维化的细胞因子,当TGF-β活性增强时,HSCs会分泌更多的胶原沉积到损伤部位,加重肝纤维化,增强ECM合成并抑制其降解,由于TGF-β可以激活HSCs,使其分化为肌成纤维细胞样细胞,因此被广泛应用于体外构建HSCs的活化模型中[13]。竞争性内源性RNA（competing endogenousRNA,ceRNA）假说是指mRNA和非编码RNA等通过与miRNA竞争相同的miRNA应答元件（MicroRNA Response Elements,MREs）调节各自的表达水平[14]。有研究报道,长链非编码RNA（Long non-codingRNA,LncRNA）NEAT1在酒精性脂肪性肝纤维化（Alcoholic Fatty Liver Fibrosis,ASH）的血清中高表达,并且可以通过与miR-129-5p竞争型结合,促进细胞因子信号抑制剂2的表达促进ASH的发生[15]。目前并未出现ceRNA在胆汁淤积性肝纤维化中的相关的报道。本研究旨在通过对胆管结扎（BDL,Bile Duct Ligation）小鼠HSCs样本芯片数据进行加权基因共表达分析（Weighted Gene Correlation Network Analysis,WGCNA）,筛选出与胆汁淤积性肝纤维化发生相关的关键基因,通过在线网站预测可能与关键基因结合的miRNA及LncRNA,并在TGF-β活化的肝星状细胞LX-2中验证“LncRNA-miRNA-mRNA”的表达是否符合ceRNA网络假说,最终我们筛选出与胆汁淤积性肝纤维化发生相关的LncRNA LINC00663,目前未发现有关于LINC00663在肝纤维化中的相关报道,因此我们探究了LINC00663在HSCs中的细胞学功能、作用机制及对BDL小鼠模型肝纤维化的影响,并对其分子学机制进行讨论,为胆汁淤积性肝纤维化的诊断和治疗提供理论依据和治疗靶点。研究方法:1、小鼠肝星状细胞样本芯片数据分析（1）通过5例静息状态的小鼠HSCs、3例经BDL活化的小鼠HSCs的芯片数据进行WGCNA,筛选出与细胞状态高度相关的模块;（2）取高度相关模块中前5%的基因作为关键基因进行Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）、Gene Ontology（GO）分析,探究与胆汁淤积性肝纤维化进展相关的信号通路及细胞生理过程;（3）取高度相关模块中前5%的基因进行蛋白互作网络（Protein Protein Interaction Network,PPI）的构建,并采用mcode软件对PPI中的关键基因和紧密簇进行筛选,以探究与胆汁淤积性肝纤维化相关的关键基因;2、构建胆汁淤积性肝纤维化相关的ceRNA网络及在活化的HSCs中验证其表达情况（1）采用10ng/ml TGF-β活化肝星状细胞LX-2,分别作用24h和48h,通过qRT-PCR检测α-SMA、COL1A1的mRNA及蛋白的表达情况,验证活化的LX-2细胞模型是否构建成功;（2）qRT-PCR检测TGF-β活化48h后的LX-2细胞系中FN及EDA-FN的mRNA及蛋白表达水平,验证FN、EDA-FN在活化后的LX-2细胞系中的表达情况;（3）qRT-PCR检测TGF-β活化48h后的LX-2细胞系中SF2的mRNA及蛋白的表达水平,验证SF2在活化后的LX-2细胞系中的表达情况;（4）通过Targetscan及miRDB软件预测可以与SF2结合的miRNA,并通过qRT-PCR在TGF-β活化48h后的LX-2细胞系中验证miRNA的表达情况;（5）通过RegRNA软件预测可以与miR-3916结合的LncRNA,并通过qRT-PCR在TGF-β活化48h后的LX-2细胞系中验证LncRNA的表达情况;3、评估LINC00663在活化的HSCs中生物学功能（1）构建LINC00663敲减及过表达模型,qRT-PCR检测LINC00663在LX-2中的表达水平,敲减的siRNA及过表达的质粒均由吉玛公司提供;（2）qRT-PCR及WB检测α-SMA、COL1A1的mRNA及蛋白表达水平,评估LINC00663对LX-2细胞系活化水平的影响;（3）划痕实验、Transwell、Western Blotting（E-CAD、DESMIN、VIMENTIN）评估LINC00663对LX-2细胞系迁移能力及EMT水平的影响;4、在体验证LINC00663对BDL小鼠肝纤维化的调控作用 20只8-9w小鼠随机平均分为四组:假手术组（sham:只游离胆管不结扎,n=5）、手术组（BDL,n=5）、BDL+对照质粒组（BDL+NC,n=5）及BDL+过表达质粒组（BDL+OE,n=5）,使用质粒转染LX-2细胞,构建稳转细胞系,尾静脉注射于BDL小鼠模型中,评估LINC00663在体内对BDL小鼠肝纤维化的影响（肝脏中LINC00663表达水平,肝脏中羟脯氨酸含量,血清ALT、AST含量,HE染色,Masson染色,免疫组化检测α-SMA、COL1A1）;5、LINC00663在胆汁淤积性肝纤维化过程中的作用机制研究（1）在LX-2细胞中进行RNA-FISH实验,确定LINC00663的细胞定位;（2）验证LINC00663与miR-3916之间的作用:qRT-PCR检测敲减及过表达LINC00663后LX-2细胞中miR-3916的表达;双荧光素酶报告基因实验验证LINC00663是否可以与miR-3916结合;（3）验证miR-3916对LINC00663的调控作用:qRT-PCR检测敲减及过表达miR-3916后LX-2细胞中miR-3916的表达;qRT-PCR检测敲减及过表达miR-3916后LX-2细胞中LINC00663的表达;（4）Rescue实验验证LINC00663对LX-2细胞活化的促进作用是否可以被miR-3916逆转;（5）Rescue实验验证LINC00663对LX-2细胞迁移及EMT的促进作用是否可以被miR-3916逆转;（6）验证SF2与miR-3916之间的作用:双荧光素酶报告基因实验验证SF2是否可以与miR-3916结合;（7）验证LINC00663与SF2及FN、EDA-FN的调控关系:qRT-PCR检测敲减及过表达LINC00663后LX-2细胞中SF2及FN、EDA-FN的表达情况;（8）Rescue实验验证LINC00663/miR-3916/SF2-FN作用轴调控关系;（9）RIP验证miR-3916与LINC00663、SF2存在竞争性调控关系;研究结果:1、加权基因共表达实验分析结果（1）经探针转化和合并重复基因后,获得21747个基因。方差分析法计算并筛选出前25%的基因（N=5437）用于共表达网络的构建,选择了无标度拓扑拟合指数达到0.84的β=10作为软阈值幂,并将样本的临床特征引入加权网络后,研究发现darkolivegreen模块（r=0.99,P＜0.05）和darkgrey模块（r=-0.89,P＜0.05）与细胞状态高度相关;（2）高度相关模块中前5%的基因作为关键基因的GO和KEGG Pathyway分析结果显示,多个与肝纤维化发生发展相关的通路及细胞生理过程有意义（包括细胞周期、ECM受体相互作用、器官再生等）P＜0.05;（3）116个关键基因的PPI网络包含116个节点和157个边线,共得到degree＞10的7个关键基因（包括FN、Alb、Mki67、CDK1、Birc5、Mad2l1、Prc1）,选择其中得分最高的FN进行后续实验;2、ceRNA网络构建及验证（1）qRT-PCR检测TGF-β活化肝星状细胞α-SMA、COL1A1的mRNA及蛋白的表达情况,结果显示,与对照组0h相比,活化24h和活化48h的肝星状细胞α-SMA、COL1A1的mRNA及蛋白表达水平均升高,P＜0.05,表明活化模型构建成功;（2）qRT-PCR检测TGF-β活化肝星状细胞48h后的LX-2细胞中FN及EDA-FN的mRNA及蛋白表达水平,结果显示,活化48h的肝星状细胞FN及EDA-FN的mRNA及蛋白表达水平均升高,P＜0.05;（3）qRT-PCR检测TGF-β活化肝星状细胞48h后的LX-2细胞中SF2的mRNA及蛋白表达水平,结果显示,活化48h的肝星状细胞SF2的mRNA及蛋白表达水平升高,P＜0.05;（4）通过Targetscan及miRDB软件进行预测,发现miR-3916可以结合SF2,qRT-PCR检测TGF-β活化肝星状细胞48h后的LX-2细胞中miR-3916的表达水平,结果显示,活化48h的肝星状细胞miR-3916的表达水平降低,P＜0.05;（5）通过RegRNA软件进行预测,发现LINC00663可以结合miR-3916,qRT-PCR检测TGF-β活化肝星状细胞48h后的LX-2细胞中LINC00663的表达水平,结果显示,活化48h的肝星状细胞LINC00663的表达水平升高,P＜0.05。3、LINC00663促进HSCs活化、迁移及EMT作用（1）在TGF-β活化后的LX-2细胞中转染siRNA及过表达质粒,qRT-PCR检测LINC00663的表达情况,结果显示,转染了siRNA的LX-2细胞中LINC00663的表达显著下降,转染了LINC00663的过表达质粒的LX-2细胞中LINC00663的表达显著上升,P＜0.05;（2）与NC组比较,转染siRNA之后,LX-2细胞中α-SMA、COL1A1的mRNA及蛋白表达水平均显著降低,P＜0.05;转染过表达质粒之后,LX-2细胞中α-SMA、COL1A1的mRNA及蛋白表达水平显著升高,P＜0.05;（3）通过划痕实验证明,与NC组比较,转染siRNA之后,LX-2细胞的迁移能力降低,转染LINC00663的过表达质粒之后,LX-2细胞的迁移能力升高,P＜0.05;通过Transwell实验证明,与NC组比较,转染siRNA之后,LX-2细胞的迁移能力降低,转染过表达质粒之后,LX-2细胞的迁移能力升高,P＜0.05;Western Blotting结果显示,与NC组比较,转染siRNA之后,LX-2细胞的EMT能力降低,转染LINC00663的过表达质粒之后,LX-2细胞的EMT能力升高,P＜0.05;4、在体验证LINC00663对BDL小鼠肝纤维化的调控作用,结果显示:与BDL+NC组比较,BDL+OE组小鼠肝脏LINC00663表达升高,P＜0.05;羟脯氨酸含量增多,P＜0.05;HE、Masson及α-SMA、COL1A1的免疫组织化学染色的表达水平结果表明,与BDL+NC组相比,BDL+OE组的肝纤维化程度更明显并且α-SMA、COL1A1表达水平也更高;5、LINC00663通过竞争性抑制miR-3916促进SF2剪切FN促进胆汁淤积性肝纤维化的发生发展（1）LX-2细胞RNA-FISH实验结果显示:LINC00663在细胞核和细胞质中均有表达;（2）qRT-PCR检测敲减及过表达LINC00663后LX-2细胞中miR-3916的表达,结果显示,si-LINC00663组miR-3916分子表达水平升高,过表达LINC00663组miR-3916分子表达水平降低,P＜0.05;双荧光素酶报告基因实验验证LINC00663可以与miR-3916特异性结合,P＜0.05;（3）qRT-PCR检测敲减及过表达miR-3916后LX-2细胞中miR-3916的表达,结果显示,与NC组相比,转染了miR-3916 mimic的细胞中的miR-3916的表达水平均显著升高,转染了miR-3916 inhibitor的细胞miR-3916表达显著降低,P＜0.05;qRT-PCR检测敲减及过表达miR-3916后LX-2细胞中LINC00663的表达,结果显示,与NC组相比,miR-3916 mimic组LINC00663分子表达水平降低,P＜0.05;miR-3916 inhibitor组LINC00663分子表达水平升高,P＜0.05;（4）与LIN-si相比,同时转染了LIN-si和miR-inhibitor组α-SMA、COL1A1分子水平均有所上调,说明miR-3916 inhibitor可以有效逆转因LINC00663敲减引起的α-SMA、COL1A1水平的降低,P＜0.05;与LIN-OE相比,同时转染了LIN-OE和miR-mimic组α-SMA、COL1A1分子水平有所下调,说明miR-3916 mimic可以有效逆转因LINC00663过表达引起的α-SMA、COL1A1水平的升高,P＜0.05;（5）划痕实验结果说明,miR-3916 inhibitor可以有效逆转因LINC00663敲减引起的LX-2细胞迁移能力的降低,P＜0.05;miR-3916 mimic可以有效逆转因LINC00663过表达引起的LX-2细胞迁移能力的的增强,P＜0.05;Transwell实验结果说明,miR-3916 inhibitor可以有效逆转因LINC00663敲减引起的LX-2细胞迁移能力的降低,P＜0.05;miR-3916 mimic可以有效逆转因LINC00663过表达引起的LX-2细胞迁移能力的的增强,P＜0.05;Western Blotting结果说明,miR-3916 inhibitor可以有效逆转因LINC00663敲减引起的LX-2细胞EMT能力的降低,P＜0.05;miR-3916 mimic可以有效逆转因LINC00663过表达引起的LX-2细胞EMT能力的的增强,P＜0.05;（6）双荧光素酶报告基因实验验证SF2可以与miR-3916特异性结合,P＜0.05;（7）验证LINC00663与SF2及FN、EDA-FN的调控关系:qRT-PCR及WB检测敲减及过表达LINC00663后LX-2细胞中SF2及FN、EDA-FN的mRNA及蛋白表达情况,结果显示,相比NC组,si-LINC00663组SF2及EDA-FN的mRNA及蛋白表达水平均升高,P＜0.05,但FN的mRNA及蛋白表达水平无明显变化,P＞0.05;过表达LINC00663组SF2及EDA-FN分子及蛋白表达水平均降低,P＜0.05,但FN的mRNA及蛋白表达水平无明显变化,P＞0.05;（8）与LIN-si相比,同时转染了LIN-si和miR-inhibitor组SF2、EDA-FN分子水平均有所上调,说明miR-3916 inhibitor可以有效逆转因LINC00663敲减引起的SF2、EDA-FN水平的降低,P＜0.05;与LIN-OE相比,同时转染了LIN-OE和miR-mimic组SF2、EDA-FN分子水平有所下调,说明miR-3916 mimic可以有效逆转因LINC00663过表达引起的SF2、EDA-FN水平的升高,P＜0.05。（9）RIP结果显示,与Ig G组相比,Ago2组miR-3916、LINC00663、SF2的富集程度均明显升高,P＜0.05;结论:1.细胞功能学实验结果显示LINC00663具有促进LX-2细胞活化、迁移及EMT作用;2.动物实验结果证明,LINC00663可以促进BDL小鼠的肝纤维化发展;3.LINC00663促纤维化作用机制主要是通过竞争性抑制miR-3916的活性,协同促进SF2对FN的剪切作用,在胆汁淤积性肝纤维化的诊断及靶向治疗方面具有潜在的临床意义。