背景与目的:孢子丝菌是一种可引起孢子丝菌病的双态真菌,是由巴西孢子丝菌、狭义的申克孢子丝菌、球形孢子丝菌、鲁里氏孢子丝菌、墨西哥孢子丝菌和苍白孢子丝菌组成的混合物。孢子丝菌病通过创伤性接触被真菌污染的泥土、植物和有机物质而引发。孢子丝菌病通常表现为丘疹或脓疱,形成累及局部淋巴管的溃疡结节,它分为皮肤型、肺型和播散型,其中皮肤型是最常见的疾病形式。孢子丝菌感染机体时,天然免疫系统是最初始的防御。有研究表明孢子丝菌病小鼠模型中涉及多种免疫学反应,申克孢子丝菌感染可引发机体的2型T细胞免疫,由申克孢子丝菌的细胞壁所组成的抗原成分可对孢子丝菌病实验模型中的1型T细胞免疫产生抑制。失能同源物2（Disabled homolog 2,DAB2）首次在巨噬细胞集落刺激因子1（CSF-1）刺激诱导的巨噬细胞中被鉴定出来,是低密度脂蛋白受体（LDHR）、II型生长因子β受体（TGFβR）和整合素β1（integrinβ1）的内吞适配器物。DAB2参与了多种免疫信息通道,例如Ras/MAPK和TGF-β通路。有研究显示在脂肪组织中,DAB2被快速下调后显著激活树突细胞及其免疫反应功能。然而,在孢子丝菌病的巨噬细胞中,DAB2的表达及其发挥的免疫调节作用尚不明确。c-JUN氨基末端激酶（JNK）信号通路参与细胞分化、转化及生存等多个重要的细胞过程。有研究表明JNK通路的激活可作为巨噬细胞由抗炎表型向促炎表型转化的开关,并且对于炎症组织中巨噬细胞的聚集和高脂饮食诱导的胰岛素抵抗是必需的。JNK通路在孢子菌病中发挥的作用以及是否参与调控DAB2从而影响巨噬细胞炎症反应是未知的。已有报道表明温热疗法可有效治疗孢子丝菌病,但温热疗法是否通过DAB2发挥免疫调节作用尚未明确。因此我们旨在探究申克孢子丝菌感染巨噬细胞时引起的免疫反应及其机制,以及42℃温热对巨噬细胞免疫功能的调节方式。研究方法:1.在本研究中,首先用免疫印迹法及荧光定量PCR法检测孢子丝菌病小鼠皮损处及未患病的正常小鼠皮肤中Dab2基因的表达情况。进一步检测孢子丝菌病皮损处巨噬细胞中DAB2的表达量改变。为了进一步明确孢子丝菌病中巨噬细胞的Dab2基因表达是否发生变化,我们提取小鼠股骨干中的骨髓原代巨噬细胞进行体外研究,采用以往文献报道的菌与细胞比例的申克孢子丝菌量感染骨髓原代巨噬细胞,检测DAB2的表达。2.由于DAB2对于一些炎症因子的控制作用已经被报道,我们采用了荧光定量PCR的方式检测了被申克孢子丝菌感染的骨髓原代巨噬细胞中Il6、Tnfα、Il1β、Arg1、Il10和Mgl1的m RNA水平变化。接着对原代巨噬细胞中Dab2基因进行敲低,检测DAB2低表达的原代巨噬细胞中Il6、Tnfα、Il1β、Arg1、Il10和Mgl1的m RNA水平。3.为了检测申克孢子丝菌对骨髓原代巨噬细胞中Dab2基因可能的调控作用方式,我们通过http://jaspardev.genereg.net网站检索出c-JUN可能是DAB2基因的转录因子。用免疫印迹的方法检测了申克孢子丝菌感染的巨噬细胞中c-JUN的表达变化,及与c-JUN密切相关的JNK通路磷酸化变化。并且用JNK通路的激活剂激活骨髓原代巨噬细胞的JNK活性后,再用申克孢子丝菌感染骨髓原代巨噬细胞,提取总蛋白检测DAB2、c-JUN及JNK通路磷酸化,探究申克孢子丝菌刺激的骨髓原代巨噬细胞中JNK通路对c-JUN及DAB2的调节。4.我们对骨髓原代巨噬细胞的c-JUN蛋白进行敲减,再给予细胞申克孢子丝菌刺激,检测Dab2的转录情况。同时采用染色质免疫共沉淀和荧光素酶报告基因的方法检测c-JUN是否作为转录因子直接参与调节Dab2转录。5.之后提取孢子丝菌病小鼠的皮损和未患孢子丝菌病的正常小鼠皮肤处的总蛋白质,用免疫印迹法检测c-JUN和JNK通路磷酸化蛋白表达,辅助验证细胞实验的结果。6.我们用荧光定量PCR及Western Blot检测42℃温热处理后巨噬细胞的Dab2的m RNA及蛋白变化。7.最后采用染色质免疫功沉淀检测42℃温热处理后,c-JUN和c-FOS与Dab2的启动子区域结合情况变化。结果:1.Western Blot结果显示与正常小鼠皮肤处相比,孢子丝菌病小鼠皮损处DAB2表达增高,差异在统计学上有意义。免疫荧光显示相同放大倍数的相同大小视野中,表达DAB2蛋白的巨噬细胞数目增多,差异在统计学上有意义。按申克孢子丝菌:细胞=5:1的比例,用相应数量的申克孢子丝菌感染骨髓原代巨噬细胞时,Dab2的m RNA水平在24h内先增高再回降,差异在统计学上有意义。申克孢子丝菌感染导致骨髓原代巨噬细胞的DAB2表达增高,并在24小时内均保持较高的水平,差异具有统计学意义。2.在申克孢子丝菌的感染的骨髓原代巨噬细胞中炎症因子Tnfα、Il10和Mgl1的m RNA水平增高,Il6、Il1β和Arg1的m RNA水平降低,差异具有统计学意义。与阴性对照相比,在接受申克孢子丝菌刺激后,Dab2敲低的骨髓原代巨噬细胞Il6、Tnfα、Il10和Mgl1的m RNA水平降低,Il1β和Arg1的m RNA未发现明显改变。3.在申克孢子丝菌感染的骨髓原代巨噬细胞中,c-JUN的蛋白表达在1小时升高,3～6小时持续降低,12小时升高,24小时再次降低。并且申克孢子丝菌刺激降低JNK的磷酸化水平。在JNK激活剂胡桃宁激活JNK通路磷酸化的情况下,与未被申克孢子丝菌刺激相比,申克孢子丝菌刺激的巨噬细胞DAB2蛋白表达无明显变化,c-JUN蛋白表达增高,JNK磷酸化水平无明显变化。4.c-JUN蛋白敲减的骨髓原代巨噬细胞中,Dab2的m RNA水平降低,差异具有统计学意义。与阴性对照细胞相比,c-JUN蛋白敲减的骨髓原代巨噬细胞被申克孢子丝菌刺激后,Dab2的m RNA水平降低,差异具有统计学意义。并且染色质免疫共沉淀显示,与阴性对照抗体相比,c-JUN抗体能够沉淀更多的Dab2基因启动子区域片段。荧光素酶报告基因结果显示,启动子区域上游-2100碱基长度构建的质粒表达更多下游的荧光蛋白。启动子区域上游-630碱基长度构建的质粒荧光强度显著降低,具有统计学差异。5.与正常皮肤组织相比,孢子丝菌病小鼠皮损处的JNK磷酸化水平较低,c-JUN蛋白表达水平较高,差异均具有统计学意义。6.与37℃处理组相比,42℃温热使c-JUN和DAB2表达降低,差异具有统计学意义。7.与37℃处理组相比,42℃温热处理的巨噬细胞中c-JUN和c-FOS沉淀的Dab2启动子区域片段减少。8.37℃处理的巨噬细胞c-JUN和c-FOS位于细胞核,42℃温热处理的巨噬细胞c-JUN定位于细胞核,c-FOS定位于细胞质中。结论:1.孢子丝菌病小鼠皮疹处的DAB2表达增高,其中真皮巨噬细胞中的DAB2表达增多。小鼠骨髓原代巨噬细胞中Dab2的转录和翻译水平均被申克孢子丝菌诱导,并且申克孢子丝菌通过Dab2调节炎症因子Tnfα、Il1β、Arg1、Il10和Mgl1的m RNA水平。2.申克孢子丝菌抑制JNK通路磷酸化,从而诱导c-JUN表达。3.c-JUN可作为Dab2基因的转录因子发挥调节作用。4.在孢子丝菌病小鼠体内JNK通路被抑制和c-JUN蛋白表达增高。5.42℃温热通过抑制c-JUN表达和促进c-JUN/c-FOS二聚体分离抑制Dab2转录。