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目的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)向成骨细胞及脂肪细胞分化的“失衡”与骨质疏松症和肥胖等疾病密切相关。尽管越来越多研究表明micro RNA(miRNA)参与BMSCs成骨/成脂分化的调控,从而影响骨形成,但miR-196b-5p对骨形成的影响尚未见报道。本课题组成员通过前期研究发现,miR-196b-5p在体外实验中可抑制BMSCs向成骨细胞分化,并且促进其向脂肪细胞分化,但未进行体内研究。在此基础上,本研究通过构建成骨细胞特异性miR-196b-5p转基因鼠模型,观察miR-196b-5p在体内对骨形成、骨重建和骨量的影响;其次,通过体外机制研究明确miR-196b-5p调控BMSCs成骨分化作用的靶基因及相关信号通路;最后,探讨miR-196b-5p抑制剂对绝经后骨质疏松小鼠骨丢失的防治作用。方法本研究共分为三部分。第一部分通过构建2.3 kbⅠ型胶原(Collagen type I,Col1a1)启动子控制的成骨细胞特异性miR-196b-5p转基因鼠模型(Col1a1-miR-196b转基因鼠),研究miR-196b-5p在小鼠体内对骨形成、骨重建和骨量的影响。取转基因鼠及同窝野生对照鼠进行以下实验研究:(1)小鼠饲养于无病原体环境中并观察大体表型;(2)通过X光及μCT等影像学方法分析胫骨干骺端骨量及骨形态静力学参数变化;(3)通过阿尔新蓝/苏木素/橙黄G染色,观察胫骨干骺端骨小梁、脂肪细胞和生长板软骨的变化;(4)通过免疫组化方法对胫骨干骺端组织行碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色,计数ALP阳性成骨细胞数目;(5)分离3日龄内颅骨细胞分别进行体外诱导成骨和成脂分化培养;(6)通过钙黄绿素双标记实验,评估骨矿化速率;(7)通过ELISA方法检测反映骨转换率的血清骨钙素水平;(8)通过抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRACP)染色观察骨吸收情况。本研究第二部分通过体外机制研究明确miR-196b-5p调控BMSCs成骨分化作用的靶基因及相关信号通路,方法内容包括:(1)首先利用生物信息学相关软件及结合文献分析预测并筛选出miR-196b-5p调控BMSCs成骨分化作用的候选靶基因,再通过双荧光素酶报告实验和Western blotting对候选靶基因进行鉴定。(2)通过对前述鉴定的靶基因进行功能获得和功能缺失实验明确靶基因对BMSCs向成骨细胞和脂肪细胞分化的调控作用。(3)通过拯救实验观察靶基因对miR-196b-5p调控BMSCs成骨/成脂分化作用的影响。(4)通过Western blotting检测miR-196b-5p及相应靶基因对成骨分化相关信号通路蛋白水平的影响。最后,本研究第三部分探讨了miR-196b-5p inhibitor对绝经后骨质疏松小鼠骨丢失的防治作用。主要包括:(1)检测老龄小鼠骨组织及去卵巢小鼠骨髓基质细胞miR-196b-5p的表达。(2)向去卵巢小鼠胫骨骨髓腔内注射miR-196b-5p inhibitor进行在体转染,通过μCT及苏木素-伊红(HE)染色方法分析miR-196b-5p inhibitor是否能逆转骨量减少的表型。结果第一部分,与同窝野生对照小鼠相比,Col1a1-miR-196b转基因鼠:(1)6月龄时身长明显减少;(2)胫骨干骺端和腰椎骨小梁骨密度(Bone Mineral Content/Bone Volume,BMC/BV)、骨小梁相对容积(Bone Volume/Tissue volume,BV/TV)、骨小梁数量(Trabecular Number,Tb.N)均减小,骨小梁结构模型指数(Structure Model Index,SMI)和骨小梁分离度(Trabecular Separation/Spacing,Tb.Sp)增加,胫骨骨皮质密度及骨皮质厚度(Cortical Thickness,Cort.Th)均减小;(3)组织学示胫骨干骺端骨小梁减少,脂肪细胞数量增加,关节软骨和生长板软骨细胞形态及排列无明显变化;(4)胫骨干骺端骨小梁上ALP阳性的成骨细胞数目减少;(5)颅骨细胞体外成骨分化能力减弱,向脂肪细胞转分化能力增强;(6)骨矿化沉积率降低;(7)血清骨钙素水平下降;(8)胫骨干骺端破骨细胞数目减少。第二部分:(1)双荧光素酶报告实验及Western blotting均证明生物信息学预测的候选靶基因信号素3a(Semaphorin 3a,Sema3a)是miR-196b-5p直接作用的靶基因。(2)过表达Sema3a促进BMSCs的成骨分化,抑制其成脂分化;敲减Sema3a抑制BMSCs的成骨分化,促进其成脂分化(3)SEMA3A可逆转miR-196b-5p对BMSCs成骨/成脂分化的调控作用。(4)miR-196b-5p mimics抑制Wnt/β-catenin信号通路,miR-196b-5p inhibitor和SEMA3A激活Wnt/β-catenin信号通路。第三部分:(1)老龄小鼠骨组织及绝经后小鼠骨髓基质细胞miR-196b-5p表达均上调。(2)胫骨骨髓腔在体转染miR-196b-5p inhibitor可增加绝经后骨质疏松小鼠胫骨干骺端骨量,并减少其干骺端脂肪细胞数目。结论骨组织及骨髓基质细胞miR-196b-5p的表达与增龄性及绝经后骨量减少相关。miR-196b-5p可通过靶向阻断SEMA3A蛋白翻译而抑制Wnt/β-catenin信号通路,在小鼠体内异常升高可抑制成骨分化,促进脂肪细胞形成,降低成骨活性,减少骨形成,促进骨质疏松发生。miR-196b-5p抑制剂有效增加小鼠长骨干骺端松质骨量,减少脂肪细胞生成,对绝经后骨质疏松症具有一定防治潜力。总之,本研究丰富了对骨代谢调控规律的认识,为骨质疏松症等代谢性骨病提供了新的发病机制及防治靶点。