Argonaute家族蛋白是小RNA介导的基因沉默复合体（RISC）中的核心蛋白，能够结合小RNA以及剪切靶标基因。其中Piwi亚家族是Argonaute蛋白家族的一个亚支，首先在生殖干细胞中被发现。2006年，多个实验室在哺乳动物和果蝇中发现了与Piwi亚家族蛋白互作的小RNA（piRNA和rasiRNA）。此后，Piwi亚家族蛋白以RISC核心蛋白的身份重新登上研究舞台。　　 目前，对Piwi亚家族蛋白的了解仍十分有限，对Piwi亚家族蛋白的研究局限于部分模式生物中，如大小鼠、人、斑马鱼及果蝇。除了果蝇之外，在庞大的昆虫物种中，对Piwi亚家族的了解几乎为零。本论文主要研究了重要的经济昆虫（家蚕和蜜蜂）中Piwi亚家族蛋白的基因结构特征及其表达谱，探讨了Piwi亚家族蛋白对昆虫生殖发育的作用，为进一步研究昆虫piRNA及其与Piwi亚家族蛋白互作奠定基础。　　 一、家蚕Piwi亚家族蛋白基因克隆与转录本分析　　 利用家蚕基因组数据库与已知的Piwi亚家族蛋白，通过同源搜索，预测得到家蚕的两个Piwi蛋白基因，命名为siwi1和siwi2。RT-PCR成功扩增出家蚕两个Piwi基因的部分编码区，随后进一步利用RACE技术克隆得到了siwi1和siwi2的3’末端。利用EST数据库和电子克隆方法，预测得到siwi1基因的部分5’UTR、完整的编码区和部分3’UTR。RT-PCR成功验证了这个转录本的存在。基因结构分析表明，siwi1基因的编码区含有18个外显子和17个内含子，并且第3个内含子是其中最长的一个内含子。保守结构域分析表明，Siwi1蛋白含有Argonaute家族蛋白的特征结构域：PAZ和PIWI结构域，同时预测得到了3个保守的motif，而这三个motif都在PIWI结构域中。进化分析表明，Siwi1与果蝇Aub和Piwi相似性高，而Siwi2与果蝇Ago3在进化上有着很高的相似性。　　 二、家蚕Piwi亚家族蛋白表达谱分析　　 采用实时荧光定量PCR分析家蚕Piwi亚家族蛋白在不同发育阶段和不同组织（头，马氏管、丝腺、消化道、精巢和卵巢）中的表达情况。数据分析表明，家蚕两个Piwi亚家族基因在卵中表达量最高。发育至1龄初孵幼虫时，两个Piwi基因的mRNA水平明显下降，并且在幼虫阶段维持在一个相对较低的水平，发育至4龄（siwi1）或者5龄（siwi2）幼虫时表达量达到最低。之后siwi1和siwi2的表达量快速上升，至蛹和成虫期达到一个较高水平。在六个不同组织中，siwi1和siwi2在精巢和卵巢中高表达，而在马氏管、丝腺、消化道中表达量明显减弱。有意思的是，家蚕两个Piwi亚家族蛋白在头部的表达量都相对较高，siwi2基因在头部的表达甚至略高于精巢和卵巢。　　 三、蜜蜂Piwi亚家族蛋白基因克隆与转录本分析　　 通过RT-PCR验证了预测的意大利蜜蜂Piwi基因转录本的存在（分别命名为Am-aub和Am-ago3）。通过RACE技术分别扩增得到Am-aub和Am-ago3的5’和3’末端，并通过end-end PCR进行了验证。同时还扩增得到了多个Am-aub和Am-ago3基因的不同剪切转录本。基因结构分析表明，Am-aub基因共有7个外显子，而Am-ago3基因有13个外显子。保守结构域分析表明，蜜蜂两个Piwi亚家族蛋白都含有PAZ和PIM结构域。在PAZ结构域中预测到小RNA的结合位点，在PIWI结构域中预测到小RNA的5’结合位点和剪切催化残基三联体DDH。进化分析表明，Am-aub与家蚕Siwi1相似性最高，而Am-ago3与果蝇Ago相似性最高。　　 四、蜜蜂Piwi亚家族蛋白表达谱分析　　 利用实时荧光定量PCR分析了Am-aub和Am-ago3在不同蜂型（工蜂、蜂王和雄蜂）中的表达谱，发现两个Piwi基因在雄蜂中的表达量都显著高于工蜂和蜂王，而蜂王和工蜂的表达差异不显著。分析Am-aub和Am-ago3在工蜂和蜂王中的变化发现，在蜂王的幼虫中，两个Piwi基因表达量较低，蛹期后表达量迅速升高，化蛹后第2天达到最高点，随后迅速下降。在蛹后期中的表达量与成虫一致；在工蜂的幼虫中，两个Piwi基因的表达量也较低，但持续缓慢地增高，至蛹期增高幅度明显加快，至蛹后期达到最高点后迅速下降。成虫期Am-aub和Am-ago3基因的表达水平都比幼虫阶段低。