肺动脉高压(PAH)是心血管外科领域内常见的并发症，尤其见于先天性心脏病。其基本病理改变为以血管壁中膜平滑肌增生为特点的血管重构。以往研究表明肺血管壁平滑肌增殖增生是受内皮细胞旁分泌所产生的细胞因子的严密调控的。而由于肺高灌注所引起的肺动脉高压的病理改变中，肺小动脉内皮细胞往往受损、坏死及功能异常，导致局部细胞因子分泌紊乱，诱导中膜平滑肌细胞增殖增生，肺血管重构。近年来，在外周血中发现具有分化为内皮细胞潜能的内皮祖细胞，此类细胞可以迁移到受损组织局部并分化为有正常分泌功能的内皮细胞。因此内皮祖细胞可以既作为内皮组织修复工具，又可同时作为有效的目的基因载体。降钙素基因相关肽(CGRP)具有强大的肺血管舒张及抑制平滑肌增殖的作用，在肺动脉高压的病理过程中其水平，以往研究证实CGRP通过与血管壁平滑肌细胞表面的CGRP受体结合，明显缓解肺动脉高压。本研究将外源性CGRP基因转染内皮祖细胞，并将携带外源CGRP基因的内皮祖细胞通过颈静脉注射给左向右分流引起的肺动脉高压的大鼠模型，观察其缓解肺动脉高压及抑制肺血管重构的治疗作用，以期为肺动脉高压的发病机制和临床治疗提供理论基础和实验依据。方法本研究采用外周血单个核细胞密度梯度离心的方法采集外周血单个核细胞，经过细胞因子的定向诱导分化，进行细胞培养至一周，利用DiI-acLDL，FITC-Ulex-lectin双荧光显色法及CD34，CD133细胞表面标志物的流式细胞术(FACS)对内皮祖细胞进行鉴定。根据CGRP全长cDNA序列设计一对CGRP开放阅读框上下游引物，并分别引入EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点，以pGEM-T-CGRP为模板进行逆转录扩增反应，将PCR产物与真核表达载体pEGFP-N1进行EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切，酶切产物片段经过纯化后，进行连接反应后转化大肠杆菌E.coli DH5α，转化子经过质粒扩增提取后，经电穿孔法转染内皮祖细胞，通过倒置荧光显微镜观察绿色荧光，并通过放射免疫方法测定细胞培养液中CGRP浓度，证实内皮祖细胞成功转染外源质粒基因并且可分泌CGRP。将转染细胞分成2×10~6 cells／mL小单位准备进行静脉注射。将6-8周龄的无胸腺裸大鼠随机分成4组，分别为对照组、左向右分流组、分流+EPC移植组及分流+CGRP-EPC移植组。通过腹主动脉与相邻下腔静脉之间建立左向右分流通道，饲养10周，以完成动力性肺动脉高压动物模型的建立。以1×10~6 EPCs，1×10~6 CGRP-EPCs(均为500uL)分别经过颈静脉注射给分流+EPC移植组及分流+CGRP-EPC移植组，继续饲养4周。以右心导管法测量各组大鼠肺动脉压力，通过热稀释方法测量肺血管阻力(PVR)，取大鼠肺叶组织，利用放射免疫方法测定肺组织内以及血浆中的CGRP含量，同时提取肺组织内的RNA，采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定CGRP mRNA含量。针对大鼠CD31抗原，采用小鼠抗大鼠CD31单克隆抗体结合免疫荧光技术检测EPC在肺组织内的分布。肺叶组织进行切片，HE染色，并利用计算机图象分析技术检测肺小动脉结构变化并进行组间比较，切取肺组织小块(1mm×1mm×1mm)，系列脱水固定后，进行透射电镜观察各组肺小动脉壁超微结构变化。另外取24只大鼠随机分为3组，进行分流手术后分别接受EPC移植，CGRP-EPC移植，其余一组不接受细胞移植，采用Kaplan-Meier方法进行生存分析。结果1．从人外周血中分离的单个核细胞经过细胞因子诱导后，3天后可见细胞伸展，并见梭形细胞；5天形成细胞集落，约一周左右形成典型的铺路石样结构，出现多个细胞团，中间为圆形细胞，贴壁的梭型细胞从细胞团的周围向外生长，第10天左右可见首尾相连形成条索状结构。荧光显微镜下可观察到同时发绿色(DiI-acLDL)和红色(FITC-Ulex-lectin)荧光的双阳性贴壁细胞。FACS检测，CD34阳性率为77.2％±10.9％，和AC133阳性率为27.1％±9.1％。2．重组质粒pEGFP-N1-CGRP经酶切鉴定正确。体外经电穿孔转染内皮祖细胞的转染阳性率为46％。转染CGRP基因的内皮祖细胞24小时后对其培养液经放免测定发现有CGRP分泌，并且于第5天其分泌值达到高峰，分泌持续达3周以上。分流手术的大鼠接受CGRP-EPC后其肺组织内CGRP的含量较单纯分流手术组的大鼠显著增加(P＜0.05)，在所有接受分流手术大鼠的血浆中CGRP含量均较对照组降低，而接受分流手术的3组大鼠之间并无显著差异(P＞0.05)。3．细胞移植4周后经过RT-PCR检测各组大鼠肺组织内的CGRP mRNA均有表达，而接受CGRP-EPC移植的实验组大鼠其肺组织内的CGRP mRNA含量明显高于其余3组大鼠(P＜0.05)。4．免疫荧光检测发现在细胞移植4周后，接受CGRP-EPC移植的实验组大鼠的肺组织血管床散在有绿色荧光分布，在其余3组大鼠的肺组织内未见绿色荧光分布；在CGRP-EPC组大鼠的心脏，肝脏以及肾脏等主要器官内均未发现有明显的绿色荧光分布。5．肺组织切片染色病理检查发现接受EPC或是CGRP-EPC移植组大鼠的肺小动脉管壁面积百分比同单纯分流组相比较均显著降低(P＜0.05)，而管腔面积百分比却显著增加(P＜0.05)；经过计算机定量分析分流组大鼠的肺小动脉管壁厚度较对照组明显增加，而接受EPC或是CGRP-EPC移植组大鼠的肺小动脉管壁增厚程度较单纯分流组显著减轻(P＜0.05)；CGRP-EPC组较EPC组比较其减轻程度更加明显(P＜0.05)。6．肺小动脉超微结构观察发现在单纯分流组大鼠其肺小动脉血管壁内皮细胞肿胀增大，并见内皮细胞坏死从管壁脱落现象，内弹力膜崩解，细胞外基质以及胶原纤维堆积；在EPC移植组发现内皮细胞变性与再生同时并存，内皮细胞与基底膜连接较为疏松；而在CGRP-EPC移植组中见到再生的内皮细胞与基底膜连接较为紧密，细胞形态接近正常，细胞的变性坏死现象减少。7．血流动力学检查发现单纯接受分流手术组大鼠的平均肺动脉压力(mPAP)及肺血管阻力(PVR)均较对照组明显增加(P＜0.05)；接受EPC或是CGRP-EPC移植组大鼠的肺血管阻力与单纯分流组相比均有所降低(P＜0.05)，而CGRP-EPC移植组的肺血管阻力明显低于EPC组(P＜0.05)；肺动脉压力在单纯分流组与EPC移植组之间无显著差别(P＞0.05)，而CGRP-EPC移植组的肺动脉压力却较单纯分流组和EPC移植组有明显降低(P＜0.05)。体循环血流动力学参数(血压、心率、心输出量、体循环血管阻力)在4组之间无明显差异(P均＞0.05)。8．对Kaplan-Meier生存分析显示CGRP-EPC移植组大鼠的生存率显著高于分流组(P＜0.05)，而EPC移植组的生存率与分流组相比并未见显著差异(P＞0.05)。结论1．从人类外周血分离出的单个核细胞经过适当细胞因子诱导培养可以得到具有生物活性和分化潜能的内皮祖细胞用于细胞移植。2．可以人工构建包含外源CGRP基因的真核质粒表达载体，通过体外转染内皮祖细胞，产生并分泌具有生物学活性的CGRP。3．内皮祖细胞在体内可以定向迁移并停留在受损的肺血管内皮，作为基因载体的同时发挥局部组织修复的作用。4．通过颈静脉注射CGRP-EPC能够缓解左向右分流引起的动力性肺动脉高压并降低肺血管阻力，抑制肺血管壁平滑肌增殖增生，在一定程度上逆转肺血管重构。5．CGRP转基因内皮祖细胞系统靶向性治疗技术可以作为一种具有潜力的动力性肺动脉高压的临床治疗方法。