研究背景食管癌（esophagealcancer,EC）的发病率和死亡率分别占全球癌症相关发病率和死亡率的第七位和第六位,2020年最新数据表明,全球每年约有60.4万例新发EC患者,其中死亡病例高达54.4万例。近年来,全球EC新增病例呈上升趋势,特别在中国,每年新增病例超过47.79万例,死亡病例达37.5万例。目前,EC的主要治疗策略是手术治疗、放疗和化疗。虽然EC的诊断和治疗在过去的几十年里有了很大的进步,但EC的5年生存率仍低于20%。因此,寻找和开发新的治疗药物或新的治疗方法至关重要。G四链体（G-quadruplexes,G4）是DNA或RNA富含鸟嘌呤（G）的核酸序列形成的高级结构,在基因组中进化高度保守,该结构并非随机分布在基因组中,它们主要分布在功能基因组区域,如端粒、转录因子结合位点以及一些原癌基因的启动子区域等。G4与许多细胞功能有关,如DNA复制、基因表达、端粒维持和细胞凋亡等。鉴于G4在基因组中的高度保守性和功能重要性,其有望成为一种新的癌症治疗靶点。近年来,G4配体已成为医学相关研究热点之一。迄今为止,已经鉴定出了大约1000种不同的G4配体。其中,TMPyP4是明星G4配体之一。多项研究已证实TMPyP4能够靶向G四链体发挥抗肿瘤作用。此外TMPyP4也是一种新型的合成水溶性光敏剂,用于光动力治疗（photodynamic therapy,PDT）。最近有研究表明,TMPyP4通过诱导人端粒G4复合物的形成,在治疗骨肉瘤方面比顺铂更有效。因此,TMPyP4可能是一种很有前景的癌症治疗药物。研究表明,多种肿瘤组织和细胞中的G4明显增多,本研究首次发现食管癌细胞中的G4较正常食管细胞增多。然而,G4配体TMPyP4对食管癌的影响尚不清楚。研究目的1.明确TMPyP4对食管癌细胞生物学行为的影响;2.初步探讨TMPyP4对食管癌发挥抗肿瘤作用的潜在机制。材料和方法1 TMPyP4对食管癌细胞和正常食管细胞增殖的影响1.1 采用CCK8实验检测TMPyP4处理前后人食管癌细胞和正常食管细胞活性的改变。1.2 采用EdU-DNA合成实验检测TMPyP4处理前后食管癌细胞增殖的变化。2 TMPyP4对食管癌细胞和正常食管细胞凋亡的影响2.1 采用流式细胞术检测TMPyP4处理前后人食管癌细胞和正常食管细胞凋亡的变化。2.2 采用Western blot方法检测TMPyP4处理前后人食管癌细胞的凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的相对表达情况。3 TMPyP4对食管癌细胞和正常食管细胞周期的影响3.1 采用流式细胞术检测TMPyP4处理前后人食管癌细胞和正常食管细胞周期分布的变化。3.2 Western blot检测TMPyP4处理前后人食管癌细胞的周期相关蛋白CDK4、CyclinD1的相对表达水平。4 TMPyP4对食管癌细胞迁移及侵袭的影响4.1 采用细胞划痕实验检测TMPyP4处理前后人食管癌细胞的迁移能力。4.2 采用Transwell迁移和侵袭实验检测TMPyP4处理前后人食管癌细胞的迁移和侵袭能力。4.3 采用Western blot实验检测TMPyP4处理前后人食管癌细胞的迁移及侵袭相关蛋白MMP-2的相对表达水平。5 TMPyP4处理食管癌细胞前后转录组测序分析5.1 将KYSE-510食管癌细胞分成两组,实验组组加入50μM的TMPyP4作用48h,对照组不加药,提取总RNA后建库上机,利用转录组测序完成差异表达基因分析。以校正后p＜0.05且|Log2Foldchange|＞1作为筛选标准筛选显著性差异表达基因,随后完成差异表达基因的功能注释、GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。5.2 qRT-PCR验证KEGG富集通路中缺氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor-1,HIF-1）通路的差异表达基因。5.3 Western blot和qRT-PCR分别检测TMPyP4处理前后人食管癌细胞中HIF-1a蛋白和基因表达的变化。6 食管癌和正常食管细胞中G-四链体的差异采用特异性G-四链体抗体BG4进行免疫荧光实验,检测人食管癌细胞和正常食管细胞中G-四链体的差异。7 TMPyP4处理后食管癌细胞中G-四链体的改变采用特异性G-四链体抗体BG4进行免疫荧光实验,检测TMPyP4处理前后人食管癌细胞KYSE-510中G-四链体的变化,从而评估TMPyP4稳定G4的能力。8 统计学分析运用统计学工具SPSS 21.0对实验结果进行统计分析,数据使用均数±标准差表示。两组间差异比较用t检验法,多组间比较用单因素方差分析法,Corrplot R包用于做相关性分析,GOplotR包用于差异基因的富集分析。使用GraphPad 8.0软件做图。结果1 TMPyP4对食管癌细胞和正常食管细胞增殖的影响1.1 CCK8实验结果显示,TMPyP4可以抑制食管癌细胞的增殖,而对正常食管细胞HEEC几乎没有影响。对TMPyP4处理48h后食管癌细胞半数抑制浓度（IC50）进行评估,我们发现KYSE-510是对TMPyP4最敏感的细胞系,IC50值为53±0.89 μM,因此我们选择了KYSE-510进行后续实验。1.2 EdU-DNA合成实验结果显示:TMPyP4处理48h后可以剂量依赖的方式抑制食管癌细胞KYSE-510的增殖,差异有统计学意义（p＜0.05）。2 TMPyP4对食管癌细胞和正常食管细胞凋亡的影响2.1 流式细胞术凋亡分析结果表明,TMPyP4可以剂量依赖性的方式诱导食管癌细胞KYSE-510凋亡;而对正常食管细胞HEEC基本无影响。2.2 Western blot检测KYSE-510食管癌细胞凋亡相关蛋白。结果显示,TMPyP4处理KYSE-510细胞后抗凋亡蛋白Bcl-2明显降低,而凋亡蛋白Bax则显著上升,差异有统计学意义（p＜0.05）。3 TMPyP4对食管癌细胞和正常食管细胞周期的影响3.1 流式细胞术周期分析结果显示,TMPyP4引起食管癌细胞KYSE-510细胞周期发生G2/M期阻滞,而对正常食管细胞HEEC细胞周期分布无明显影响。3.2 Western blot检测食管癌细胞KYSE-510细胞周期相关蛋白,结果显示,TMPyP4处理后KYSE-510细胞周期蛋白CDK4和CyclinD1降低,差异有统计学意义（p＜0.05）。4 TMPyP4对食管癌细胞迁移及侵袭的影响4.1 细胞划痕结果显示,KYSE-510食管癌细胞经TMPyP4处理12h和24h后细胞划痕区愈合速度较对照组减慢,差异有统计学意义（p＜0.05）,TMPyP4能够抑制食管癌细胞KYSE-510的迁移。4.2 Transwel迁移和侵袭实验结果结果表明,相比于对照组,TMPyP4处理后Transwell实验中迁移和侵袭的癌细胞数量明显减少,差异有统计学意义（p＜0.05）,TMPyP4能够抑制食管癌细胞KYSE-510的迁移和侵袭。4.3 Western blot检测KYSE-510食管癌细胞迁移及侵袭相关蛋白指标,结果显示,基质金属蛋白酶（MMP）蛋白家族成员MMP-2在TMPyP4处理后降低,差异有统计学意义（p＜0.05）。5 TMPyP4处理食管癌细胞前后转录组测序分析按照p＜0.05且|Log2Foldchange|＞1的条件选择差异表达基因（differential expressed genes,DEG）,共筛选出209个DEG,其中115个基因表达上调,94个表达下调。DEG的GO富集分析表明,差异表达基因在生物学过程部分主要富集到了血管生成、缺氧应激和糖酵解过程等方面;在细胞组分部分主要富集在细胞外间隙、细胞外泌体和胞外区域等部位;在分子功能方面,差异表达基因主要富集到了肝素结合、Ras鸟嘌呤核苷酸交换因子活性和蛋白聚糖结合。KEGG通路富集分析显示差异表达基因主要富集在HIF-1信号转导通路、癌症信号通路、PI3K-Akt信号转导通路、细胞周期信号通路等。而HIF-1信号通路是富集到的最显著的信号通路,富集在该通路上的基因（HMOX1;SERPINE1;SLC2A1;EGLN3;PDK1;HKDC1;HK2;PFKFB3）基本都是显著下调。qRT-PCR随机验证了HIF-1信号通路中 6 个关键基因（SLC2A1;PFKFB3;EGLN3;HKDC1;HK2;PDK1）的相对表达量,均与转录组测序中的变化趋势一致,这也验证了转录组测序中的变化趋势。此外,TMPyP4处理后KYSE-510细胞中HIF-1a基因和蛋白表达水平均下调。6 食管癌细胞和正常食管细胞中G-四链体的差异免疫荧光显示,人食管癌细胞KYSE-510中BG4表达（即G-四链体）明显高于正常食管细胞HEEC。7 TMPyP4处理后食管癌细胞中G-四链体的改变免疫荧光显示,与对照组相比,TMPyP4处理后BG4表达（即G-四链体）明显减少。结果表明,TMPyP4可能会降低KYSE-510细胞中G-四链体的稳定性。结论1.TMPyP4可抑制食管癌细胞增殖,促进其凋亡,引起细胞周期阻滞在G2/M期,并抑制食管癌细胞迁移及侵袭,但对正常食管细胞无明显作用。2.TMPyP4发挥抗食管癌的作用机制可能是通过影响HIF-1a G4结构稳定性,从而影响HIF-1a及HIF-1通路中相关基因的表达发挥抗肿瘤作用。