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自禽流感发现以来，该病在世界各地不断爆发，给世界的养禽业带来了很大的经济损失。近几年来H9亚型低致病性禽流感对养禽业的危害已经引起了人们的高度重视。为了解河南H9亚型的免疫原性、细胞培养特性以及分子生物学特性，进行了以下研究。于2011年用SPF鸡胚从河南漯河、郑州市疑似感染H9亚型禽流感病毒的病料中分离出2株病毒，通过血凝及血凝抑制试验和RT-PCR方法进行鉴定，确定为AIV H9亚型；用河南省动物性食品安全重点实验室于2001年分离的2株H9亚型禽流感病毒分别制成油乳剂灭活疫苗免疫SPF鸡，然后再用上述4株病毒对免疫鸡群进行交叉攻毒，测定其交叉免疫保护作用。结果表明：成功分离出2株H9亚型禽流感病毒；用2001年分离毒株所制备出的灭活疫苗免疫鸡后，试验鸡体内抗H9亚型禽流感HI抗体效价均明显上升，平均HI效价均为11log2，不同毒株所诱导产生的HI抗体效价存在一定的差异；2001年的分离株对目前的流行毒株仍具有很好的保护作用且，同一地区的保护率更高。将H9亚型禽流感病毒接种于MDCK细胞，通过血凝效价检测，对其维持液中胰酶浓度、血清浓度、吸附时间、接种量、培养时间以及传代次数等条件进行比较和优化。试验结果表明：当病毒接种量为胚毒的10-1稀释，吸附时间为90min，维持液中血清浓度为0，胰酶浓度为1.0μg/mL，在MDCK细胞上培养72h时病毒的血凝滴度最高可达到7log2；分离自漯河的两株毒只能在MDCK细胞上传代3次，之后血凝效价为0，而分离自郑州的两株毒可在MDCK细胞上连续传代十次以上，ZZ11株在MDCK细胞上传代45次后还可以继续传代。通过对4株H9亚型禽流感病毒分离株的HA、NA基因进行序列分析结果表明， LH11株H9亚型禽流感病毒的HA基因片段为1707bp，最大ORF全长为1518bp，位置为190-1707位核苷酸，编码505个氨基酸，其余3个毒株及ZZ11株细胞培养毒的HA基因片段均为1742bp，ORF位置均为34-1716位核苷酸，全长为1683bp，均编码560个氨基酸。4毒株的HA基因核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为92.5%~98.8%、93.3%~97.9%。 ZZ01、ZZ11、LH11株NA基因片段均为1469bp，LH01株的为1470bp，ORF位置均为20-1420位核苷酸，全长为1401bp，均编码466个氨基酸。4株毒的NA基因核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为93.4%~99.7%、93.6%~99.4%。4株河南分离株在HA裂解位点处存在2种氨基酸排列顺序，分别为PSRSSR↓GLF和PVRSSR↓GLF，符合低致病性禽流感病毒裂解位点的氨基酸序列特征。4株河南分离株的HA基因受体结合位点除234位外，其余7个位点均一致，其中109位、161位、163位、191位、202位、203位的这6个受体结合位点与4个代表的一致；在198位，4个分离株与CK/BJ/1/94代表株的一致，为V；CK/HK/G9/97、CK/HK/G23/97这两个代表株的一致，为A；DK/HK/Y280/97代表株的为T。所有分离株226位氨基酸为G，说明均为禽源禽流感病毒，而郑州分离株的234位为L，呈现出了人流感受体结合特性。漯河分离株的HA基因LH11株有5个糖基化位点，LH01株有7个糖基化位点；而郑州分离株的糖基化位点均为8个，其中315位氨基酸突变为S使其在该处增加了一位糖基化位点，漯河分离株该位氨基酸为P。4个分离株NA茎部均存在第62、63、64位氨基酸I、T、E的缺失导致了第61位糖基化位点的缺失。漯河分离株NA基因由于45位氨基酸突变为L，而代表株为P，所以此处增加了一个潜在的糖基化位点；郑州分离株由于264位氨基酸突变为N，而代表株为H，所以此处增加了一个潜在的糖基化位点；ZZ11株由于368位氨基酸突变为N，而代表株为K或E，所以此处增加了一个潜在糖基化位点，ZZ01株由于402为氨基酸突变为S，而代表株为N，导致该处糖基化位点缺失。通过对ZZ11株与其4代细胞毒的HA、NA基因进行分析，ZZ11株胚毒与细胞毒的HA基因核苷酸与氨基酸序列同源性分别为99.3%～99.6%、98.8%～99.3%，NA基因核苷酸与氨基酸序列同源性分别为99.7%～99.9%、99.1%～99.8%。核苷酸同源性为99.3%，氨基酸同源性高达98.8%以上，说明其在MDCK细胞上的传代非常稳定。HA、NA基因进化树分析显示，与HA基因进化关系最近的为DK/HK/Y280/97株，属于欧亚谱系中的Y280群系；与NA基因进化关系最近的也为DK/HK/Y280/97株。这些结果为河南H9亚型禽流感病毒的分离培养方法及防治提供技术依据。