目的:本研究建立大鼠心肌缺血再灌注模型,模拟急性心肌梗死后再灌注损伤的病理生理变化,在大鼠造模前三苦滴丸溶剂进行有效的干预,旨在观察三苦滴丸在保护心肌、抗细胞凋亡等方面的作用,并探讨三苦滴丸对凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Cyt C以及caspase-3的影响,进一步探讨其作用机制。从而为中医药在临床上治疗心肌缺血再灌注损伤方面提供新方案。本实验共分为两部分:第一部分即证明三苦滴丸预处理是否对大鼠缺血再灌注有保护效果。第二部分即证明三苦滴丸预处理对心肌缺血再灌注的细胞凋亡及凋亡相关蛋白表达的影响。方法:第一部分:对大鼠采用结扎缺血30 min后松解结扎线进行再灌注,再灌注2h的方法制备心肌缺血再灌注损伤模型,78只大鼠,随机分为6组,分别为假手术组(n=13)、模型组对照组(n=13)、三苦低剂量组(SK0.8,n=13)、三苦中剂量组(SK1.6,n=13)、三苦高剂量组(SK3.2,n=13)及阳性药对照组(n=13)。三苦低、中、高剂量组分别每天灌胃给予受试药0.8、1.6、3.2 g/kg体重,阳性药对照组每天灌胃给予丹参滴丸0.4g/kg体重,假手术组及模型组给予等体积的0.5%羧甲基纤维素钠溶液,给药7天,末次给药后进行造模。应用配备15-MHz的现行传感器的M-型超声心动图机对大鼠心功能进行检测,利用Image-Pro Plus图像分析软件计算心肌梗死率(梗死面积与心脏切片总面积的比值)。HE染色观察心肌组织形态学变化。标本收集:实验结束时腹主动脉采血,然后将心脏取出,将左心室分成三部分,一部分用于SOD、MDA的检测;一部分用于心肌组织形态观察;剩下一部分放入-80℃冰箱中检测乳酸脱氢酶(LDH)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)的水平。第二部分:78只大鼠,随机分为6组,分别为假手术组(n=13)、模型组对照组(n=13)、三苦低剂量组(SK0.8,n=13)、三苦中剂量组(SK1.6,n=13)、三苦高剂量组(SK3.2,n=13)及阳性药对照组(n=13),剩下步骤同实验一。以TUNEL法检测凋亡心肌细胞,计算细胞凋亡指数。应用Western bloting检测各组大鼠心肌Bcl-2、Bax的表达,采用免疫组织化学方法观察Cyt C表达,以及采用分光光度法检测caspase-3的活性。结果:第一部分:1.SK对心功能的影响:1.1 SK对射血分数的影响:于再灌注后2h,通过超声心动图计算大鼠左心室射血分数(LVEF),以此来探讨大鼠左心室射血功能的变化。在灌注2h后,缺血再灌注明显降低了左心室射血分数。与Sham组比较Model组的射血分数显著降低,差异有统计学意义(P<0.01);与Model组对比,SK低剂量组(SK0.8)与SK中剂量组(SK1.6)的射血分数无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05);与Model组对比,SK高剂量组(SK3.2)的射血分数升高,差异有统计学意义(P<0.01);与Model组对比,DSP组的射血分数升高,差异有统计学意义(P<0.01)。说明SK组抑制了因缺血再灌注损伤造成的LVEF下降,结果有明显差异(P<0.01)。1.2 SK对心率的影响:心率是反映心功能的一个指标,SK各组均可增快心率。与Sham组比较,Model组大鼠的心率显著降低,差异有统计学意义(P<0.01);与Model组对比,SK低剂量组(SK0.8)大鼠的心率无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05);与Model组对比,SK中剂量组(SK1.6)、SK高剂量组(SK3.2)大鼠的心率升高,差异有统计学意义(P<0.05);与Model组对比,DSP组大鼠的心率升高,差异有统计学意义(P<0.01)。说明SK缓解了因缺血再灌注损伤所造成的心率下降,结果有明显差异(P<0.05)。2.SK对缺血再灌注损伤后心肌梗死面积的影响:SK可明显地减少缺血再灌注心肌梗死的面积。与Sham组比较,Model组大鼠的心肌梗死率明显升高,差异有统计学意义(P<0.01);与Model组对比,SK中剂量组(SK1.6)、SK高剂量组(SK3.2)的心肌梗死率明显下降,差异有统计学意义(P<0.01);与Model组对比,DSP组的心肌梗死率明显下降,差异有统计学意义(P<0.01)。说明SK组明显抑制了因缺血再灌注损伤造成的心肌梗死率,结果有明显差异(P<0.01)。3.大鼠心肌组织病理形态学:根据对HE染色在光镜下的观察结果表明,Sham组的心肌细胞形态规则、排列整齐,肌纤维完整,并未见到心肌细胞的水肿、变性以及坏死,且也无中性粒细胞浸润。Model组的心肌细胞形态不规则、排列发生紊乱,局部肌纤维横纹消失,可见心肌细胞发生水肿、且有少量的心肌细胞变性以及坏死,且伴有大量的中性粒细胞浸润。SK低剂量组(SK0.8)、SK中剂量组(SK1.6)、SK高剂量组(SK3.2)组的心肌细胞水肿减轻、中性粒细胞浸润的数量明显减少,表明SK可保护心肌受损程度的下降;而光镜下DSP组的心肌组织的病理形态与SK组相似。4.缺血再灌注对大鼠LDH、AST、CK-MB、SOD及MDA的影响:再灌注结束后检测各组LDH、AST、CK-MB、SOD及MDA值。结果显示,Model组、SK低剂量组(SK0.8)、SK中剂量组(SK1.6)、SK高剂量组(SK3.2)、DSP组的LDH、AST及CK-MB值均较Sham组明显增高(P<0.01)。Model组、SK低剂量组(SK0.8)、SK中剂量组(SK1.6)、SK高剂量组(SK3.2)、DSP组的SOD值明显降低,与Sham组比较有显著性差异(P<0.01);Model组、SK低剂量组(SK0.8)、SK中剂量组(SK1.6)、SK高剂量组(SK3.2)、DSP组的MDA值明显增高,与Sham组相比有显著性差异(P<0.01)。以上结果表明缺血再灌注可造成心肌严重损伤,证实心肌缺血再灌注模型构建成功。5.SK对缺血再灌注大鼠LDH、AST、CK-MB、SOD及MDA的影响:经统计学检验,各组间LDH、AST、CK-MB、SOD及MDA的水平均有显著差异。根据结果可得,SK低剂量(SK0.8)、SK中剂量(SK1.6)、SK高剂量(SK3.2)、DSP对LDH、AST、CK以及MDA的升高有明显的抑制作用,且SK低剂量(SK0.8)、SK中剂量(SK1.6)、SK高剂量(SK3.2)、DSP对SOD的活性有明显的增加作用,与Model组比较有统计学意义(P<0.001);对SK高剂量组(SK3.2)与DSP组的上述指标进行统计学分析(P>0.05),表明两组无统计学差异。根据以上结果可表明SK与DSP具有抗氧化作用而减轻心肌缺血再灌注损伤。第二部分:1.各组心肌组织TUNEL检测结果:按试剂盒提供的TUNEL法原位检测凋亡细胞。正常心肌细胞核呈蓝色;凋亡心肌细胞核呈深浅不一红染。与Sham组比较Model组的心肌细胞凋亡指数明显升高,差异有统计学意义(P<0.01);与Model组对比,SK低剂量组(SK0.8)、SK中剂量组(SK1.6)、SK高剂量组(SK3.2)的心肌细胞凋亡指数明显下降,差异有统计学意义(P<0.01);与Model组对比,DSP组的心肌细胞凋亡指数明显下降,差异有统计学意义(P<0.01)。说明SK组抑制了因缺血再灌注损伤造成的心肌细胞凋亡。2.Western bloting检测各组大鼠心肌Bcl-2、Bax的表达:通过分析目的条带的光密度值(IOD)发现,各组间Bcl-2、Bax、Bcl-2/Bax比值的表达均有显著差异。在Sham组中心肌组织有一定量的Bcl-2及Bax表达,Model组心肌Bcl-2蛋白表达显著减少,而Bax表达显著增加(P<0.01),Bcl-2/Bax比值显著降低;SK中剂量(SK1.6)、SK高剂量组(SK3.2)和DSP组中Bax表达较Model组显著下降(P<0.01),但Bcl-2的表达及Bcl-2/Bax比值较Model组显著升高(P<0.01)。SK高剂量组(SK3.2)和DSP组中Bcl-2、Bax无显著性差异(P>0.05);此两组中Bax表达与Sham组比较无显著性差异(P>0.05)。3.各组Cyt C的表达:根据免疫组织化学方法观察Cyt C表达。在Sham组中Cyt C的含量极少,但在Model组中可以看到Cyt C含量的显著增加,但在SK中剂量(SK1.6)、SK高剂量组(SK3.2)和DSP组中Cyt C表达较Model组显著下降(P<0.01),对比SK高剂量组(SK3.2)和DSP组中Cyt C表达无明显差异(P>0.05)。4.各组caspase-3活性检测结果:caspase-3蛋白表达水平表达情况,各组间caspase-3蛋白表达水平差异显著。正常心肌细胞的caspase-3蛋白表达水平较低,Model组心肌caspase-3的蛋白表达水平明显升高;经过SK中剂量(SK1.6)、SK高剂量(SK3.2)及DSP预处理后心肌caspase-3的蛋白表达水平显著降低(P<0.01),但SK及DSP组的caspase-3蛋白表达水平间无显著性差异。结论:1本实验通过对大鼠进行心肌缺血再灌注的造模,证实了心肌损伤可因心肌缺血再灌注导致,三苦滴丸预处理可以对心肌的损伤有显著的减轻,降低了LDH、AST、CK-MB以及MDA的值,提高SOD的活性,有效地减轻了心肌缺血再灌注损伤,减少了心肌梗死面积以及缓解心律下降,改善了心脏功能,其机制可能与通过增加机体清除氧自由基的能力,减少细胞膜脂质过氧化损伤有关。2三苦滴丸通过对心肌缺血再灌注诱发的细胞凋亡的抑制而保护缺血再灌注对心肌的损伤。3三苦滴丸预处理抑制细胞凋亡的机制可能与Bcl-2的蛋白表达的上调、Bax的蛋白表达的下调,Bcl-2/Bax比值的升高,抑制Cyt C从线粒体到胞浆中含量,以及减少心肌组织中caspase-3的活性有关。