论文部分内容阅读
帕金森病（Parkinson’s Disease,PD）是一种常见于老年且严重影响人类生活质量的神经退行性疾病之一。PD的病理特征为中脑黑质多巴胺神经元退行性病变和神经元胞浆内出现特征嗜酸性的包涵体-Lewy Bodies。PD的发生被证实与多个基因突变相关,如SNCA-A53T、LRRK2-G2019S等。Rab29参与高尔基复合体形态的维持和介导甘露糖6磷酸受体的逆向运输。有学者在果蝇模型中通过siRNA在多巴胺神经元选择性沉默Rab29直接同系物导致多巴神经元大量的丢失。Rab29与LRRK2密切相关,但近两年有相关研究显示,敲除LRRK2和Rab29的小鼠不会引起PD样的病理和行为学改变,内源性Rab29不会影响基础或已被刺激状态下的LRRK2激酶活性。而Rab29对A53T突变导致α-synuclein聚集的影响还很少有研究。本实验通过小鼠模型进行了 5种药物筛选以及设置高低月龄组小鼠用于探索α-synuclein寡聚体和Rab29的表达量是否存在相互影响。通过果蝇模型建立了三种不同激活程度的dRab29果蝇品系,比较各组的生命周期、运动能力、α-synuclein、酪氨酸羟化酶、MAPK通路相关蛋白表达量。实验结果表明,在小鼠模型中,内源性Rab29表达与α-synuclein寡聚体水平呈负相关关系;在果蝇模型中,持续激活型dRab29能通过下调ERK-MAPK的激活程度和Active Caspase3表达量,挽救A53T突变给果蝇带来的神经毒性,减少α-synuclein的表达。这些结果说明Rab29能影响α-synuclein的代谢。目的:通过建立小鼠以及果蝇模型,探讨Rab29是否影响α-synuclein的代谢。方法:1.取6月龄和24月龄的A53T突变小鼠和对应年龄的空白对照组小鼠脑部黑质组织后,Western Blot检测其黑质Rab29,α-synuclein寡聚体的表达量。同时眼球取血,ELISA检测外周血α-synuclein的水平。2.筛选目前未在临床上使用的能促进α-synuclein至溶酶体降解的药物Lysosome-2、3、4、5、6,筛选出促α-synuclein代谢效果最好的药物后,检测此组小鼠Rab29蛋白表达水平。3.获得同时表达A53T和TH-GAL4的纯合果蝇品系（A53T-TH）。接着将A53T-TH和TH-GAL4分别与野生型dRab29 WT、持续激活型dRab29 Q79L、显性负效应型dRab29 T33N杂交,分别获得以下6种果蝇品系:（1）;;TH-GAL4/UAS-dRab29 WT,（2）;;TH-GAL4/UAS-dRab29 Q79L,（3）;UAS-dRab29 T33N/+;TH-GAL4/+（4）UAS-A53T/+;;TH-GAL4/UAS-dRab29 WT（5）UAS-A53T/+;;TH-GAL4/UAS-dRab29 Q79L（6）UAS-A53T/+;UAS-dRab29 T33N/+;TH-GAL4/+。4.评估野生型,持续激活型,显性负效应型三种dRab29对DA神经元的影响,选取方法3中（1）、（2）、（3）3种品系果蝇以及野生型果蝇W1118,每组挑取雌蝇分为3个平行组,每组20只,统计分析其生命周期,运动能力和酪氨酸羟化酶（TH）的表达与野生型果蝇W1 118是否有差异。5.评估野生型、持续激活型、显性负效应型三种dRab29分别在A53T突变果蝇身上的神经毒性作用。选取方法3中（4）、（5）、（6）3种品系果蝇以及阳性对照A53T-TH,每组挑取雌蝇分为3个平行组,每组20只,进行生命周期和爬行检测,并检测果蝇脑组织α-synuclein、TH、MAPK通路相关蛋白的表达量。结果:1.24月龄A53T突变小鼠与6月龄A53T突变小鼠相比,α-synuclein寡聚体含量增多,外周血α-synuclein水平提高。24月龄A53T突变小鼠与6月龄A53T突变小鼠对比,Rab29蛋白表达量减少。24月龄的A53T突变小鼠与24月龄野生型小鼠相比,Rab29表达量减少。6月龄A53T突变小鼠Rab29蛋白表达量较6月龄野生型小鼠相比Rab29表达量同样减少。2.药物筛选结果:Lysosome-6是促α-synuclein代谢较好的药物,其所在组的小鼠Rab29与对照组相比表达量增高。3.DA能神经元表达野生型、持续激活型、显性负效应型dRab29的果蝇未见明显的神经毒性,生命周期和运动能力以及TH的表达与W1 118相比无显著性差异。4.持续激活型dRab29的A53T突变果蝇会延长A53T突变果蝇的生命周期,改善其运动能力,减少了 A53T果蝇的α-synuclein的表达量,减轻了 A53T突变对TH含量的影响,下调了 p-ERK和Active-Caspase3的表达程度。结论:1.高月龄A53T小鼠α-synuclein水平高于低月龄A53T小鼠,而Rab29水平与α-synuclein水平呈负相关,α-synuclein表达量越高,Rab29表达量越低。在筛选出促α-synuclein代谢的效果最好的化合物Lysosome-6中,此组小鼠Rab29水平提高。此结果说明内源性Rab29和因A53T突变产生的α-synuclein两者的表达可能存在相互影响。2.在果蝇实验中,从生命周期统计、行为学实验和Western Blot分析,持续激活型dRab29能够改善A53T突变对果蝇的神经毒性,并减少了 A53T-TH果蝇α-synuclein的表达量以及对TH的影响。通过检测MAPK通路上的相关蛋白水平,持续激活型dRab29抑制ERK-MAPK通路的激活,降低Active Caspase3的表达水平进而降低A53T突变对果蝇的神经毒性。