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目的:观察类固醇激素对嗅感觉神经元(olfactory receptor neurons,ORNs)环核苷酸门控通道(cyclic nucleotide-gated channel,CNGchannel)的影响,探讨类固醇激素治疗嗅觉障碍的可能机制。
方法:
1.CNG通道CNGA2(cyclic nucleotide-gated channel alpha2)亚基基因表达量的检测:将40只Wistar大鼠随机分为四组(每组10只),24小时激素组、2周激素组及各自对照组。激素组大鼠腹腔注射地塞米松(Dexamethasone):24小时激素组按1mg/kg体重给药一次,2周激素组按0.2mg/d给药。各对照组均给予生理盐水腹腔注射。通过实时荧光定量RT-PCR方法,检测各组ORNs的CNG通道CNGA2亚基mRNA的表达量。
2.CNG通道配体环腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)生成量的检测:取6只大鼠,提取ORNs膜蛋白,加入终浓度为0.1mg/ml和1mg/ml的倍他米松(Betamethasone)预孵育,采用酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)观察不同孵育时间点(5分钟和30分钟)CNG通道配体cAMP生成量的变化。
3.ORNs内钙离子浓度的测量:急性分离大鼠ORNs,分别给予0.1mg/ml和1mg/ml的倍他米松,采用激光共聚焦钙离子成像技术,比较药物作用前后ORNs内钙离子浓度。
结果:
1.24小时激素组CNG通道CNGA2亚基基因表达水平与对照组相比差异无显著性意义(P>0.05),2周激素组CNGA2亚基mRNA表达明显上调(P<0.01)。
2.0.1mg/ml和1mg/ml的倍他米松可提高大鼠ORNs中cAMP生成量(P<0.05),且呈浓度依赖性;倍他米松预孵育5分钟后即引起cAMP浓度的快速升高,直到30分钟仍维持较高水平,两个时间点比较差异无显著性意义(P>0.05)。
3.急性分离的ORNs加入倍他米松前后钙离子浓度基本保持在同一水平。
结论:类固醇激素通过基因组效应使CNG通道CNGA2亚基mRNA表达上调,通过非基因组效应使CNG通道配体cAMP的生成增多,进而影响嗅觉信号的转导过程。