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链球菌是导致奶牛传染性慢性乳腺炎的第一大类细菌,感染率很高。奶牛乳腺炎严重影响了原料奶质量、奶牛的利用年限、奶牛养殖效益、牛奶制品的营养价值和消费者的健康。国内外学者对此病的研究己有百余年的历史,在抗生素使用、疫苗免疫和抗性基因标记角度都取得了显著的成绩,但尚未达到彻底解决的目标。1.本研究利用链球菌构建中国荷斯坦奶牛乳腺炎疾病模型,采用"Agilent4×44K bovine microarray"在全基因组范围内筛选与奶牛链球菌型乳腺炎紧密相关的差异表达基因,期望初步阐明奶牛链球菌型乳腺炎的免疫调控机理。结果表明本研究成功地建立了奶牛临床型链球菌性乳腺炎疾病模型,通过对感染后奶牛临床症状的观察及各项指标的检测,证实该模型真实地反映了链球菌感染奶牛乳腺炎的发病过程。表达谱芯片分析共发现136个差异表达基因(Fold change≥2.0,P≤0.05),其中58个基因在链球菌组表达下调,78个基因表达上调。将差异表达基因进行GO分析,发现这些基因的功能分类中与免疫有关的有73条。结合KEGG数据库对差异表达基因进行Pathway分析,发现这些基因涉及的Pathway共有38条,其中与免疫有关的Pathway有13条,分别是补体及凝血级联反应、致心律失常性右室心肌病、肥厚型心肌病、扩张型心肌病、白细胞跨内皮细胞迁移、趋化因子信号通路、病毒性心肌炎、细胞因子-细胞因子受体的相互作用、酪氨酸蛋白激酶-信号转导子与转录激活子信号通路、基础转录因子、丝裂原活化蛋白激酶信号通路、细胞粘附分子、转化生长因子-β信号通路。结合差异表达基因的功能及所参与的Pathyway,进一步筛选了19个关键基因,分别是C4BPB,CCL17,EPO,FST,IL12A,METTL13,TAF4B,ACTN2,CACNA1A, CD34, CD55, CDH13, CDH5, CXCR1, ELMO1, ITGA1, ITGB4, PROS1, VWF,可进一步研究这些基因在奶牛乳腺炎发病过程中的调控机制及其与乳腺炎抗性之间的关系。2.本研究利用亚硫酸氢盐测序技术(Bisulfite Sequencing PCR, BSP)检测5个候选基因(CDH13、EPO、METT13、CXCR1、IL12A)启动子区甲基化程度,比较感染链球菌的乳腺组织与正常乳腺组织之间甲基化程度的差异,并分析基因表达量与启动子区甲基化程度的关系,期望初步阐明DNA甲基化在奶牛链球菌型乳腺炎中的调控机制。结果表明链球菌组EPO、METTL13基因启动子区的甲基化程度显著高于PBS组(P<0.01),且这两个基因的表达量显著低于PBS组(P<0.05)。验证了基因表达量与启动子区域DNA甲基化程度之间呈负相关,初步推断这两个基因参与了链球菌型乳腺炎发病过程中的甲基化调控。