研究背景近年来,随着生活条件的改善和生活方式的改变,糖尿病(DM)发病率增长迅速,已成为威胁人类生命健康的主要杀手。目前我国已经成为本世纪DM患者最多的国家之一。作为常见的慢性渐进性代谢疾病,由于胰岛素分泌绝对或相对不足,胰岛素抵抗,DM可以导致多种糖尿病并发症,其中糖尿病性心肌病(DCM)为DM主要致残及致死原因,临床特点是患者早期心肌顺应性下降,舒张期自主充盈受限;后期心室肌收缩能力减低,易发生心律失常、充血性心力衰竭和心源性休克等。糖尿病性血管病变包括冠状动脉疾病、中风及外周肢体血管疾病等,其临床特点是血管功能及结构异常,包括动脉硬化斑块形成、血管僵硬度增加等,增加了心血管疾病的致残及致死率。DM心肌及血管损伤的病理过程复杂多样,高血糖可以诱导氧化应激反应,产生大量的活性氧簇(ROS),是DCM和糖尿病性血管病变的主要发病机制。ROS包括多种含氧自由基,如超氧阴离子(02一)、羟自由基(·OH)以及可分解生成·OH的过氧化氢(H2O2)等。理论上讲,抗氧化剂可以抑制DM心肌细胞、血管内皮细胞和平滑肌细胞等代谢紊乱诱发的氧化应激反应。N-乙酰半胱氨酸(NAC)是含巯基的谷胱甘肽(GSH)前体,作为抗氧化剂,它的分子量极小,可以自由通过细胞膜。已有研究表明,NAC抗氧化治疗可以通过保护心肌细胞和内皮细胞,减轻心肌损伤,然而ROS在心肌纤维化中的作用尚不十分清楚。探讨抗氧化治疗方案对糖尿病相关心脏和血管损害的作用,对寻找糖尿病心血管损伤的保护策略具有重要意义。另外,超声是小鼠心脏功能评价的重要手段,建立科学的超声评价方法对研究小鼠心脏功能至关重要。水合氯醛作为一种常用麻醉剂,具有安全、可靠和性价比高等优点,可以对实验用小鼠起到制动和镇静作用,但可能会对小鼠心率、心脏结构和心脏功能有一定影响,因此需要选择合适的麻醉剂量和麻醉时间。但目前此方面的研究尚较少。目的(1)探讨不同麻醉剂量于麻醉起效后不同时间点对正常小鼠及STZ诱导糖尿病小鼠心脏结构及功能的影响,进而建立并优化超声评价小鼠心脏功能的方法。(2)糖尿病模型小鼠成模后,于不同时间点给予抗氧化剂NAC治疗,观察小鼠心肌细胞形态,心肌间质纤维化程度,细胞内氧化应激水平及心脏结构和功能的改变,并探讨引起这些改变可能的机制。(3)糖尿病模型小鼠成模后,于不同时间点给予抗氧化剂NAC治疗,观察小鼠腹主动脉、肾动脉组织形态和僵硬度的改变,并分析其与左室功能和氧化应激程度的相关性。方法(1)正常雄性C57BL/6小鼠45只,随机选取15只进行STZ诱导,制作糖尿病模型。然后将30只正常小鼠和15只糖尿病小鼠分别随机分成3组,选择剂量300mg/kg,350mg/kg和400mg/kg的水合氯醛分别进行麻醉,观察小鼠麻醉起效时间、麻醉持续时间和麻醉恢复时间,分别于麻醉起效后10分钟、20分钟、30分钟测量正常小鼠心率、血糖、心脏结构、心脏收缩和舒张功能;于麻醉起效后20分钟测量糖尿病小鼠心脏结构,心脏收缩和舒张功能。(2)另外30只C57BL/6雄性小鼠,随机选取其中25只连续5天腹腔注射STZ(60mg/kg),建立糖尿病小鼠模型;对照组C57BL/6雄性小鼠5只,注射同等量枸橼酸缓冲液。第5天STZ注射结束后,测量血糖值达到13.5 mmol/L,视为糖尿病建模成功。糖尿病建模成功后,将小鼠随机分成5组,包括糖尿病组(糖尿病未治疗小鼠)和NAC治疗组,NAC治疗组以开始注射NAC治疗的时间第1、3、5、7周命名为NAC1、NAC3、NAC5和NAC7组。于糖尿病建模成功后12周,在麻醉条件下应用超声技术对各组小鼠心脏、腹主动脉和肾动脉的结构和功能进行测量。小鼠处死后,提取小鼠心脏组织、腹主动脉和肾脏,进行HE染色、Masson染色观察心肌细胞和心肌间质及血管组织结构改变;做ROS荧光探针-二氢乙啶(DHE)染色观察心肌细胞内ROS水平。结果(1)不同剂量,不同麻醉时间麻醉效果不同。研究发现,采用麻醉剂量350mg/kg麻醉起效较快,持续时间较长,麻醉状态较深,对心脏抑制作用较小;麻醉起效后20分钟,小鼠进入深度麻醉,心率相对稳定。这对于C57BL/6正常小鼠和C57BL/6糖尿病模型小鼠是比较合适的麻醉剂量和时间。(2)糖尿病模型小鼠建模成功12周后观察,可见左室内径增大,室间隔及左室后壁变薄,心脏重构,收缩及舒张功能损伤,并伴有心肌细胞排列紊乱,扭曲;心肌间质内大量胶原蛋白沉积;心肌内活性氧水平增高。抗氧化剂NAC治疗,心肌细胞间质纤维化程度减轻,心室舒张功能、收缩功能、整体功能和左室重构改善。而且越早接受NAC治疗,心脏功能和结构改善越明显。(3)糖尿病模型小鼠建模成功12周后观察,可见腹主动脉和肾动脉平滑肌细胞层数增多,排列紊乱,基质胶原纤维分布不均匀,明显增粗,血管内径增宽、僵硬度增加并且血管周围可见明显纤维化。抗氧化剂NAC治疗,可以有效抑制腹主动脉和肾动脉功能异常和重构。越早接受NAC治疗,血管功能和结构改善越明显。结论(1)水合氯醛作为本研究超声心动图检查时的麻醉用药,当采用麻醉剂量350mg/kg,麻醉起效后20分钟进行C57BL/6正常小鼠和C57BL/6糖尿病模型小鼠超声检查,对小鼠心脏结构和功能影响较小。(2)NAC治疗可以抑制由糖尿病ROS激活诱导的心肌细胞损伤和心肌间质纤维化,改善左室重构,有效保护心脏功能。NAC使用越早,上述治疗效果越明显。(3)NAC治疗可以抑制由糖尿病ROS激活诱导的血管内皮细胞及平滑肌细胞的损伤和基质纤维化,改善血管功能和血管重构。NAC使用越早,上述治疗效果越明显。