论文部分内容阅读
bcr/abl融合基因是慢性粒细胞白血病(Chronic myloid leukemia, CML)的分子标志,该基因表达具有组成型激活的酪氨酸激酶活性的Bcr/Abl融合蛋白,能够异常活化PI3K-AKT、Ras和STAT5等一系列信号通路,使血细胞恶性增殖和凋亡受阻。除此以外,Bcr/Abl融合蛋白表达的细胞中还能检测到热休克蛋白70(Hsp-70)表达水平增高,Hsp-70作为细胞应激时的保护蛋白,近年来在肿瘤的发生发展过程中受到广泛关注。Hsp-70可抑制Bax的线粒体定位,从而抑制线粒体通路的细胞凋亡；也可在线粒体下游抑制Apaf-1对caspase-9的募集作用,从而阻断caspase凋亡通路的活化。此外,Hsp-70还能抑制非caspase凋亡通路。凋亡诱导因子(Apoptosis-inducing factor,AIF)是非caspase凋亡途径的重要分子,生理条件下,AIF表达后依赖其N端1-120的线粒体定位信号(MLS)定位于线粒体,辅助呼吸链的电子传递。凋亡发生时,AIF易位至细胞核中,诱发基因组DNA断裂,促进细胞凋亡。在MEF细胞中,外源性过表达Hsp-70能够阻断AIF的细胞核定位,从而中和其促凋亡效应。AIF的150-226作为Hsp-70结合位点,介导AIF与Hsp-70直接结合,这两者之间的相互作用可能是Hsp-70影响AIF功能的主要途径。鉴于目前Hsp-70对AIF负性调节作用的研究基础,和作者所研究的CML细胞中Hsp-70内源性过表达,我们推测,AIF及其所负责的非caspase凋亡通路在CML细胞中处于失活状态,该状态与CML的发病机制可能有关。为了证明这一推测,我们拟提出以下研究思路和方法：首先,我们研究细胞在受到凋亡刺激时非caspase途径的活化状态以及AIF的功能。K562、32Dp210、Ba/F3p210以及各自的Bcr/Abl阴性对照细胞HL-60、32D、Ba/F3接受caspase抑制剂Z-VAD-FMK预处理阻断caspase通路后,采用化疗药物Vp-16诱导凋亡。采用FCM定量分析细胞凋亡,以验证非caspase通路在各细胞中的活化能力。通过western blotting和IFT方法检测内源性AIF的亚细胞定位。同时,在K562细胞中表达外源性携带HA标签的AIF突变体,该突变体缺失1-120氨基酸残基的线粒体定位序列(dMLS-AIF),能够靶向细胞核并起始凋亡。通过western blotting和IFT检测外源性AIF的亚细胞定位,流式细胞术和瑞氏染色检测细胞凋亡。其次,我们研究Bcr/Abl细胞Hsp-70的表达及其对AIF的影响。采用western blotting比较三株Bcr/Abl细胞、临床CML病人骨髓细胞以及相应的Bcr/Abl阴性对照细胞中的Hsp-70表达。通过酪氨酸酶抑制剂伊马替尼(IM)处理细胞抑制Bcr/Abl蛋白激酶活性后检测Hsp-70的表达变化以及其转录因子Hsf-1的活化水平。为证明Hsp-70的水平影响AIF的定位,我们通过siRNA靶向沉默Hsp-70,采用CCK-8和FCM检测细胞增殖、周期及凋亡。随后在Vp-16诱导下,通过western blotting和IFT检测AIF的亚细胞定位,并通过FCM和TEM方法检测caspase途径被抑制后细胞的凋亡。最后,我们研究Hsp-70抑制AIF促凋亡功能的机制。通过co-IP检测Bcr/Abl细胞在细胞凋亡时过表达的Hsp-70与释放的AIF的结合,以及K562细胞中Hsp-70与外源性HA标记的AIF突变体(dMLS-AIF)的结合。并通过pull-down检测不同细胞胞浆蛋白中Hsp-70与原核表达的AIF(HIS-AIF)蛋白的结合,以证明Hsp-70结合AIF的能力与其表达水平相关。为了证明AIF与过表达的Hsp-70结合是其入核受阻的原因,我们构建了缺失Hsp-70结合域的AIF突变体(dHBD-AIF)以破坏两者之间的相互作用,腺病毒介导在K562细胞中表达,采用co-IP验证其不能与Hsp-70结合,western blotting和IFT检测其亚细胞定位,最后通过FCM以及TEM分析dHBD-AIF诱导细胞凋亡的能力。研究结果如下：首先,Bcr/Abl细胞接受caspase抑制预处理后,Vp-16诱导的细胞凋亡完全受到抑制,而对照组细胞接受caspase抑制预处理后,凋亡率虽然下降,但仍明显高于空白对照组。说明在Bcr/Abl细胞中,非caspase通路处于失活状态。AIF是非caspase通路的重要分子,Bcr/Abl细胞中,Vp-16未能诱导AIF入核：IFT核western blotting结果均显示,AIF主要定位于细胞浆中,而Bcr/Abl阴性对照细胞中,AIF则明显在细胞核中聚集。同时,缺失线粒体定位信号的AIF突变体(dMLS-AIF)也主要在K562细胞胞浆中表达。其次,在K562、32D p210和Ba/F3p210三株细胞中,Hsp-70的水平是其Bcr/Abl阴性对照细胞HL-60、32D和Ba/F3的4-6倍；与正常人相比,CML病人骨髓细胞Hsp-70上调可高达上百倍。上调的Hsp-70与Bcr/Abl蛋白有关,IM处理可通过抑制Hsf-1活性下调Hsp-70的水平,且表现出时间与浓度的依赖性。siRNA抑制Hsp-70后,结果显示,细胞的生物学特征的改变与Hsp-70沉默效果相关,Hsp-70的沉默效果达到80%时,细胞周期受抑,凋亡增加；沉默效果达到60%时,仅细胞增殖受到影响,未有明显的凋亡发生；10-20%沉默效果未能引起明显生物学行为改变。Hsp-70沉默亦可增加Bcr/Abl细胞对Vp-16的敏感性：Hsp-70沉默组的细胞在Vp-16作用下凋亡率明显高于阴性对照组,Hsp-70沉默后,Vp-16能够成功诱导内源AIF以及外源dMLS-AIF入核。最后,与对照组相比,Bcr/Abl细胞中高表达的Hsp-70能够结合凋亡诱导时释放的AIF,K562细胞中外源表达的dMLS-AIF亦可与Hsp-70结合。因不同细胞中Hsp-70表达量的差异,所结合的AIF也不同,与K562、32Dp210细胞的胞浆蛋白共孵育的His-AIF蛋白主要呈结合状态,而与HL-60、32D胞浆蛋白共孵育后,His-AIF蛋白主要存在于穿梭液中。同时,外源表达dHBD-AIF能够破坏与Hsp-70的结合,dHBD-AIF定位于胞核中,并诱导细胞凋亡,在形态学上可见细胞的凋亡发生在染色质边集化的早期阶段。综上所述,Bcr/Abl细胞异常表达的Hsp-70通过结合AIF抑制非caspase凋亡通路的活化,下调Hsp-70可以抑制细胞增殖且促进凋亡的发生,同时也恢复AIF的核定位能力,提高了细胞对药物的敏感性。通过研究非caspase依赖的凋亡通路及其重要分子,丰富我们对CML细胞逃避凋亡的认识,也为治疗CML提供新的思路。