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TPX2是一个具有强微管组织能力的微管相关蛋白,在细胞周期运转过程中起着重要作用。细胞有丝分裂时,TPX2通过结合另一个具有重要功能的蛋白激酶Aurora A,使Aurora A的蛋白结构发生变化,保护其不被磷酸酶水解,从而激活Aurora A的激酶活性,起始一系列下游事件。另一方面,TPX2在染色体诱导的微管组织过程中是一个不可缺少的功能因子,对纺锤体正极微管组织有重要作用。 本项工作的前一部分研究主要围绕Aurora A激酶对TPX2的磷酸化修饰以及这一修饰过程所执行的功能展开。首先,作为细胞周期中起重要调控作用的蛋白激酶,Aurora A的激酶活性是通过TPX2的结合来激活并维持的,但是作为Aurora A密切的分子伴侣,TPX2是否会被活化的AuroraA磷酸化修饰并不清楚。在本项工作中,通过Aurora A磷酸化特征序列分析,在TPX2蛋白序列中找到了可能被Aurora A磷酸化的丝苏氨酸位点,并构建相应位点突变体进行体外磷酸化与放射自显影实验,最终确定了Aurora A激酶对TPX2进行磷酸化修饰的位点。之后,分别在细胞内和爪蟾卵非细胞体系中检测TPX2被磷酸化修饰后所执行的功能。结果表明,TPX2被Aurora A激酶磷酸化修饰是维持双极纺锤体两极之间正常长度所必需的。作为Aurora A激酶的下游功能因子,TPX2模拟磷酸化状态突变体可以部分的回复Aurora A缺失所造成的异常;而不能被磷酸化修饰的TPX2突变体则会影响到纺锤体正常装配,使极微管变短,并抑制染色体诱导的动粒微管产生。进一步生化分析结果显示,Aurora A对TPX2的磷酸化修饰还影响到TPX2与其它微管相关因子(如PRC1)的结合。同时,本项工作还发现了TPX2与一些维持纺锤体正常长度的因子有直接关系。因此,本项工作推测Aurora A对TPX2的磷酸化修饰可以激活TPX2作为正极微管组织因子的功能,从而使染色体诱导的动粒微管正常生长,双极纺锤体正常组装。并且根据实验结果分析,本项工作猜测Aurora A还可能通过对TPX2的磷酸化修饰间接影响到其它与TPX2结合的微管组织因子的定位与功能,从而调节纺锤体组装过程。 本项工作的另一部分则是对极低浓度紫杉醇处理细胞所产生的细胞现象及细胞命运进行深入研究。作为稳定微管药物,紫杉醇是被广泛应用的一种肿瘤治疗药物,但其在细胞内作用的分子机理一直没有完全清楚。本项工作通过极低浓度紫杉醇短时间处理细胞,观察到了由此产生的非中心体依赖的多极纺锤体组装,并首次发现了作为微管组织因子的TPX2在这一过程起到关键作用,而蛋白激酶Aurora A的激酶活性则可以对抗紫杉醇诱发的多极纺锤体组装。本项工作还对被紫杉醇处理过的细胞进行了动态跟踪观察,发现其中一部分细胞会进行多极分裂,产生具有存活与继续增殖能力的子代细胞。接着,用双色原位杂交技术对多极分裂过程中染色体在子细胞中的分配情况进行检测,发现这种分配是完全随机的,不存在特异性。将极低浓度紫杉醇处理过的细胞置于琼脂板上进行长时间培养,发现最终存活的细胞都丧失了基因组的整倍性,成为非整倍体细胞群。本项工作除了揭示紫杉醇在细胞内作用的部分分子机制以外,还通过建立极低浓度短时间处理细胞的实验体系模拟了临床治疗中的肿瘤药物残余的情况,并对该情况下细胞命运进行了跟踪观察,因此对于肿瘤药物临床使用和抗药性产生的研究具有重要的指导意义。