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第一部分miR-H6-5psponge对HSV-1急性感染及潜伏感染的调控作用研究
目的：
聚焦HSV-1病毒感染早期表达的miR-H6-5p，利用miRNAsponge揭示其对HSV-1病毒急性感染及潜伏感染的影响及机制。
方法：
1、检测miR-H6-5p在HSV-1急性感染和潜伏感染中的表达时相。
2、构建miRNAsponge表达载体，检测miR-H6-5psponge表达载体对HSV-1病毒急性感染的影响。
3、构建携带miRNAsponge的重组病毒，检测携带miR-H6-5psponge对重组病毒急性感染的影响。
4、构建不同启动子驱动的miRNAsponge表达载体，比较不同启动子驱动的miR-H6-5psponge表达载体对病毒急性感染的影响。
5、构建携带不同启动子驱动的miRNAsponge的重组病毒，比较携带不同启动子驱动的miR-H6-5psponge对重组病毒急性感染的影响。
6、检测携带miR-H6-5psponge对重组病毒在潜伏感染及激活中的影响。
结果：
1、HSV-1急性感染和潜伏感染中的表达时相：miR-H6-5p在HSV-1急性感染1小时即可检测到，而且表达丰度很高，在整个复制周期里都维持在10^6/10ngRNA以上；在潜伏感染及潜伏激活时也持续高表达。
2、miR-H6-5psponge表达载体对HSV-1急性感染的影响：a.荧光素酶活性检测显示miR-H6-5pmimic能与miR-H6-5psponge结合降低萤光素酶的表达。b.成功构建Egr启动子驱动的miRNAsponge表达载体，real-timeqPCR检测到miR-H6-5psponge的表达与报告基因GFP的表达一致。c.Real-timeqPCR结果显示miR-H6-5psponge表达载体整体降低病毒miRNA的表达。d.Westernblot、real-timeqPCR及绘制生长曲线结果显示miR-H6-5psponge表达载体能有效抑制HSV-1的急性感染。
3、携带miR-H6-5psponge对重组病毒急性感染的影响：a.成功构建Egr启动子驱动的miR-H6-5psponge重组病毒。b.Real-timeqPCR检测到重组病毒miR-H6-5psponge的表达与GFP的表达一致。c.Westernblot、绘制生长曲线方法检测显示miR-H6-5psponge对重组病毒急性感染有明显抑制作用。
4、不同启动子驱动的miR-H6-5psponge表达载体对病毒急性感染的影响比较：a.成功构建SV40、Egr、CMV启动子驱动的sponge表达载体。b.Real-timeqPCR结果显示CMV启动子表达GFP和sponge效率最高，SV40启动子和Egr启动子的表达效率相近。c.Westernblot结果显示Egr启动子驱动的sponge表达载体比SV40启动子和CMV启动子驱动的表达载体对病毒的抑制作用更明显。
5、携带不同启动子驱动的miR-H6-5psponge对重组病毒急性感染的影响比较：a.成功构建SV40、Egr、CMV启动子驱动的miR-H6-5psponge重组病毒。b.Real-timeqPCR结果显示CMV启动子重组病毒表达GFPRNA和spongeRNA效率最高，Egr启动子重组病毒在感染4小时的表达GFP和sponge效率最低，到感染20小时表达效率与SV40启动子重组病毒相近。c.Westernblot、绘制生长曲线结果显示Egr启动子驱动的sponge重组病毒比SV40启动子和CMV启动子的重组病毒生长受抑制更明显。
6、携带miR-H6-5psponge对重组病毒在潜伏感染及激活中的影响：a.小鼠经角膜感染成功。b.miR-H6-5psponge不影响重组病毒的潜伏和激活。
结论：
1、miR-H6-5p在HSV-1感染时表达早，丰度高，持续高表达。
2、miR-H6-5psponge表达载体能有效抑制HSV-1急性感染。
3、miR-H6-5psponge重组病毒在急性感染时生长明显受抑制。
4、Egr启动子驱动的miR-H6-5psponge比SV40和CMV启动子驱动的miR-H6-5psponge抑制HSV-1急性感染效率高。
5、miR-H6-5psponge不影响重组病毒的潜伏和激活。
第二部分人工microRNA靶向HSV-1基因ICP4、UL30、UL42的抗病毒感染作用研究
目的：
通过人为设计的miRNA靶向沉默HSV-1复制关键蛋白ICP4、UL30、UL42，研究其抑制病毒急性和潜伏感染的效果，探讨人工miRNA作为新的抗病毒治疗策略的可行性。
方法：
1、构建和筛选靶向沉默UL30、UL42、ICP4的人工miRNA表达载体。
2、构建靶向沉默UL30、UL42、ICP4的人工miRNA稳定表达细胞系。
3、检测人工miRNA稳定表达细胞系对HSV-1感染的影响。
结果：
1、构建和筛选靶向沉默UL30、UL42、ICP4的人工miRNA表达载体：a.成功构建靶向UL30、UL42、ICP4基因不同位点的人工miRNA表达载体。b.成功构建UL30、UL42、ICP4基因的荧光素酶报告载体和表达载体。c.荧光素酶活性检测和Westernblot筛选获得靶向UL30、UL42、ICP4基因最有效的人工miRNA表达载体(pAmiR3002、pAmiR4202、pAmiR401)。
2、构建靶向沉默UL30、UL42、ICP4的人工miRNA稳定表达细胞系:a.成功构建靶向UL30、UL42、ICP4基因的人工miRNA稳定表达细胞系(H30、H42、H401)。b.Real-timeqPCR检测人工miRNA的表达和稳定性，结果显示miR401表达量最高，达到10^7/10ngRNA；miR3002和miR4202的表达量较低，在大约10^4/10ngRNA到10^5/10ngRNA水平；在加药actinomycinD处理的12小时里人工miRNA水平保持稳定。
3、人工miRNA稳定表达细胞系对HSV-1急性感染的影响:a.Westernblot结果显示在低MOI病毒感染时(0.01/0.1 pfu/cell)，H30、H401稳定表达细胞系有明显抑制病毒复制的作用；而H42稳定表达细胞系未见明显抑制病毒复制的作用。在高MOI病毒感染时(1/10 pfu/cell)，H401稳定表达细胞系依然有明显的抑制病毒复制的作用；H30稳定表达细胞系抑制病毒复制的作用减弱；而H42稳定表达细胞系未见明显抑制病毒复制的作用。b.Real-timeqPCR检测病毒基因表达结果与WesternBlot结果一致。H30稳定表达细胞系在低MOI病毒感染时有明显抑制病毒复制的作用；H401稳定表达细胞系在高MOI病毒感染时依然有非常明显的抑制病毒作用；H42稳定表达细胞系未见明显病毒抑制作用。c.生长曲线显示H30、H401稳定表达细胞系有明显抑制病毒复制的作用，H401对病毒抑制更明显；而H42稳定表达细胞系未见明显抑制病毒复制的作用。
结论：
1、成功构建靶向沉默UL30、UL42、ICP4基因的人工miRNA表达载体。
2、成功构建靶向沉默UL30、UL42、ICP4基因的人工miRNA稳定表达细胞系。
3、人工miRNA的稳定高，不容易降解。
4、靶向沉默ICP4、UL30的人工miRNA能有效抑制病毒急性感染。
目的：
聚焦HSV-1病毒感染早期表达的miR-H6-5p，利用miRNAsponge揭示其对HSV-1病毒急性感染及潜伏感染的影响及机制。
方法：
1、检测miR-H6-5p在HSV-1急性感染和潜伏感染中的表达时相。
2、构建miRNAsponge表达载体，检测miR-H6-5psponge表达载体对HSV-1病毒急性感染的影响。
3、构建携带miRNAsponge的重组病毒，检测携带miR-H6-5psponge对重组病毒急性感染的影响。
4、构建不同启动子驱动的miRNAsponge表达载体，比较不同启动子驱动的miR-H6-5psponge表达载体对病毒急性感染的影响。
5、构建携带不同启动子驱动的miRNAsponge的重组病毒，比较携带不同启动子驱动的miR-H6-5psponge对重组病毒急性感染的影响。
6、检测携带miR-H6-5psponge对重组病毒在潜伏感染及激活中的影响。
结果：
1、HSV-1急性感染和潜伏感染中的表达时相：miR-H6-5p在HSV-1急性感染1小时即可检测到，而且表达丰度很高，在整个复制周期里都维持在10^6/10ngRNA以上；在潜伏感染及潜伏激活时也持续高表达。
2、miR-H6-5psponge表达载体对HSV-1急性感染的影响：a.荧光素酶活性检测显示miR-H6-5pmimic能与miR-H6-5psponge结合降低萤光素酶的表达。b.成功构建Egr启动子驱动的miRNAsponge表达载体，real-timeqPCR检测到miR-H6-5psponge的表达与报告基因GFP的表达一致。c.Real-timeqPCR结果显示miR-H6-5psponge表达载体整体降低病毒miRNA的表达。d.Westernblot、real-timeqPCR及绘制生长曲线结果显示miR-H6-5psponge表达载体能有效抑制HSV-1的急性感染。
3、携带miR-H6-5psponge对重组病毒急性感染的影响：a.成功构建Egr启动子驱动的miR-H6-5psponge重组病毒。b.Real-timeqPCR检测到重组病毒miR-H6-5psponge的表达与GFP的表达一致。c.Westernblot、绘制生长曲线方法检测显示miR-H6-5psponge对重组病毒急性感染有明显抑制作用。
4、不同启动子驱动的miR-H6-5psponge表达载体对病毒急性感染的影响比较：a.成功构建SV40、Egr、CMV启动子驱动的sponge表达载体。b.Real-timeqPCR结果显示CMV启动子表达GFP和sponge效率最高，SV40启动子和Egr启动子的表达效率相近。c.Westernblot结果显示Egr启动子驱动的sponge表达载体比SV40启动子和CMV启动子驱动的表达载体对病毒的抑制作用更明显。
5、携带不同启动子驱动的miR-H6-5psponge对重组病毒急性感染的影响比较：a.成功构建SV40、Egr、CMV启动子驱动的miR-H6-5psponge重组病毒。b.Real-timeqPCR结果显示CMV启动子重组病毒表达GFPRNA和spongeRNA效率最高，Egr启动子重组病毒在感染4小时的表达GFP和sponge效率最低，到感染20小时表达效率与SV40启动子重组病毒相近。c.Westernblot、绘制生长曲线结果显示Egr启动子驱动的sponge重组病毒比SV40启动子和CMV启动子的重组病毒生长受抑制更明显。
6、携带miR-H6-5psponge对重组病毒在潜伏感染及激活中的影响：a.小鼠经角膜感染成功。b.miR-H6-5psponge不影响重组病毒的潜伏和激活。
结论：
1、miR-H6-5p在HSV-1感染时表达早，丰度高，持续高表达。
2、miR-H6-5psponge表达载体能有效抑制HSV-1急性感染。
3、miR-H6-5psponge重组病毒在急性感染时生长明显受抑制。
4、Egr启动子驱动的miR-H6-5psponge比SV40和CMV启动子驱动的miR-H6-5psponge抑制HSV-1急性感染效率高。
5、miR-H6-5psponge不影响重组病毒的潜伏和激活。
第二部分人工microRNA靶向HSV-1基因ICP4、UL30、UL42的抗病毒感染作用研究
目的：
通过人为设计的miRNA靶向沉默HSV-1复制关键蛋白ICP4、UL30、UL42，研究其抑制病毒急性和潜伏感染的效果，探讨人工miRNA作为新的抗病毒治疗策略的可行性。
方法：
1、构建和筛选靶向沉默UL30、UL42、ICP4的人工miRNA表达载体。
2、构建靶向沉默UL30、UL42、ICP4的人工miRNA稳定表达细胞系。
3、检测人工miRNA稳定表达细胞系对HSV-1感染的影响。
结果：
1、构建和筛选靶向沉默UL30、UL42、ICP4的人工miRNA表达载体：a.成功构建靶向UL30、UL42、ICP4基因不同位点的人工miRNA表达载体。b.成功构建UL30、UL42、ICP4基因的荧光素酶报告载体和表达载体。c.荧光素酶活性检测和Westernblot筛选获得靶向UL30、UL42、ICP4基因最有效的人工miRNA表达载体(pAmiR3002、pAmiR4202、pAmiR401)。
2、构建靶向沉默UL30、UL42、ICP4的人工miRNA稳定表达细胞系:a.成功构建靶向UL30、UL42、ICP4基因的人工miRNA稳定表达细胞系(H30、H42、H401)。b.Real-timeqPCR检测人工miRNA的表达和稳定性，结果显示miR401表达量最高，达到10^7/10ngRNA；miR3002和miR4202的表达量较低，在大约10^4/10ngRNA到10^5/10ngRNA水平；在加药actinomycinD处理的12小时里人工miRNA水平保持稳定。
3、人工miRNA稳定表达细胞系对HSV-1急性感染的影响:a.Westernblot结果显示在低MOI病毒感染时(0.01/0.1 pfu/cell)，H30、H401稳定表达细胞系有明显抑制病毒复制的作用；而H42稳定表达细胞系未见明显抑制病毒复制的作用。在高MOI病毒感染时(1/10 pfu/cell)，H401稳定表达细胞系依然有明显的抑制病毒复制的作用；H30稳定表达细胞系抑制病毒复制的作用减弱；而H42稳定表达细胞系未见明显抑制病毒复制的作用。b.Real-timeqPCR检测病毒基因表达结果与WesternBlot结果一致。H30稳定表达细胞系在低MOI病毒感染时有明显抑制病毒复制的作用；H401稳定表达细胞系在高MOI病毒感染时依然有非常明显的抑制病毒作用；H42稳定表达细胞系未见明显病毒抑制作用。c.生长曲线显示H30、H401稳定表达细胞系有明显抑制病毒复制的作用，H401对病毒抑制更明显；而H42稳定表达细胞系未见明显抑制病毒复制的作用。
结论：
1、成功构建靶向沉默UL30、UL42、ICP4基因的人工miRNA表达载体。
2、成功构建靶向沉默UL30、UL42、ICP4基因的人工miRNA稳定表达细胞系。
3、人工miRNA的稳定高，不容易降解。
4、靶向沉默ICP4、UL30的人工miRNA能有效抑制病毒急性感染。