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鲍是海产八珍之首,2015年,我国的鲍产量已经超过13万吨,其中福建省的产量占全国的80%。皱纹盘鲍为温带种,原分布于我国黄、勃海海域,1990年代后期南移福建后,获得了极大发展,由此福建逐步成为我国鲍养殖的主产区。但福建海域的夏季高水温往往导致鲍的高死亡率,这一直困扰着鲍养殖产业的发展。因此,培育耐高温的养殖新品种显得格外重要,而其中建立鲍的耐高温性状的准确测评方法是品种培育的关键。本研究中,通过测定阿氏拐点温度(Arrhenius breakpoint temperature,ABT),建立了基于心率测定的鲍对高温耐受性的评测方法,利用这一方法结合转录组学、表观遗传学对鲍的不同耐高温特性的机制进行了探究;以鲍心率ABT测定为基础,结合微卫星分析,还探讨了鲍在高温适应中的遗传多样性的变化。本研究结果有望为鲍耐高温新品种培育提供科学依据。 1.鲍心率阿氏拐点温度(Arrhenius Breakpoint Temperature,ABT)测定方法的建立 研究了升温速率、个体大小、驯化温度、性别及饥饿情况等因素对皱纹盘鲍心率ABT测定的影响,结果表明,ABT仅与暂养温度有关,其余因素对ABT的影响极小。最终确定的皱纹盘鲍ABT测评的基础条件为:水温20℃驯化,升温速率1℃/10 min。利用这一评测方法对皱纹盘鲍、西氏鲍及西盘鲍的心率ABT进行测定,结果显示,它们的ABT值依次为:西盘鲍32.50±0.71℃、西氏鲍31.30±1.52℃、皱纹盘鲍30.00±1.23℃。 2.心率ABT测评方法的验证 以皱纹盘鲍、西氏鲍和西盘鲍为研究对象,以半数致死温度、Kaplan-Meier存活曲线、临界热最大值为研究方法,对三个群体鲍的耐高温性状进行了测定,三种测定方法的结果与心率ABT测定值基本相同,表明心率ABT适用于鲍对高温耐受性的研究。而且与其他方法相比,心率ABT的测定方法有着可单个个体测定、实验样品量少、灵敏性和准确度高、周期短和损耗少等优点。 3.鲍不同高温耐受性群体的转录组比较分析 利用心率ABT的评测方法,对皱纹盘鲍5个群体即洋下、东山、红壳色、日本以及长岛群体的耐高温性状进行测定比较,筛选出了ABT值最高与最低的洋下群体和红壳色群体。并以红壳色群体的ABT值作为胁迫条件,对两个群体的鳃组织进行转录组测序。对照组中,两个群体间存在535个差异基因,其中374个基因上调,161个基因下调(红壳色群体VS洋下群体),KEGG注释的结果表明,差异基因集中在淀粉与蔗糖代谢、氧化磷酸化以及糖类的代谢与吸收通路。红壳色群体中,对照组与应激组间共发现了3370差异基因,其中2217个基因上调,1153个基因下调(热应激组VS对照组)。而在洋下群体中,仅发现1351个差异基因,其中1121个上调,230个基因下调。热应激组与对照组间的差异基因都可注释到的通路包括了内质网蛋白加工、NOD-受体的信号通路、TNF信号通路、泛素介导的蛋白质水解、抗原的加工和递呈、细胞凋亡等通路。转录组的分析结果表明热耐受群体面对高温胁迫时,采取了一种更具针对性且高效的应对方式,表现为热应激前后转录差异的基因数少但以热休克蛋白为代表的起保护作用基因上调倍数更高。 4.鲍种间杂交子代对高温耐受性的研究 本研究中利用心率ABT测定方法,对皱纹盘鲍与绿鲍及绿鲍与西氏鲍杂交子代对高温的耐受性进行了研究,结果表明同皱纹盘鲍与西氏鲍杂交子代一样,鲍种间杂交子代对高温的耐受性都优于亲本。以皱纹盘鲍、西氏鲍和西盘鲍的鳃、外套膜和血细胞为材料,研究了HSP70与HSP90两个基因在不同温度条件下的表达情况,在高温条件(33℃)下,除血细胞中的HSP70基因,其他组织中皱纹盘鲍HSP70与HSP90基因的表达量均显著低于另外两个群体,这可能是皱纹盘鲍热耐受性差的原因之一。以三个群体不同温度条件下的鳃组织为实验材料,进行甲基化敏感扩增多态性(MSAP)分析,结果显示,三者的总甲基化水平都呈现先降低后升高的趋势,除27℃下的西氏鲍外,其他温度条件下,皱纹盘鲍的总甲基化水平都高于另外两个群体。低甲基化水平可能有利于抗逆基因的表达,因而这是西氏鲍与西盘鲍对高温耐受性强的原因之一。 5.对高温适应中鲍遗传多样性的变化 本章研究中,比较了晋江品系(皱纹盘鲍北方群体与日本群体杂交后在南方连续多代自繁)与连江品系(皱纹盘鲍北方群体与日本群体杂交子代,且采用南北接力的养殖模式)的心率ABT值,结果表明在南方海区三代自繁后,晋江品系的耐高温能力优于连江群体。微卫星的分析显示,在对南方海区高温环境适应过程中,鲍群体的遗传多样性逐渐降低,且非中性位点多样性丢失程度强于中性位点。此外,对晋江品系不同世代的分析结果显示,在对高温环境的适应中,一些稀有基因随着自繁世代地增加,其频率逐步提高。