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木质素是自然界中最丰富的芳香族聚合物可再生资源,约占陆生植物干重的15%-40%,所以其分解对于自然界碳循环是必不可少的,此外,纸浆和造纸业每年产生约6000万吨木质素,但目前只有不到2%的木质素用于商业产品,大部分被作为低成本燃料燃烧以提供热量和能量,所以建立一种高效的木质素降解体系对经济发展和环境保护具有重要意义。木质素的结构异质性和复杂性促使了微生物策略的发展,该策略利用腐烂真菌和一些细菌分泌的多种氧化酶将木质素聚合物分解为一些小片段,这些木质素低聚物在内二醇或外二醇双加氧酶的开环作用下进一步降解为碳和能源。木质素主要由愈创木酰基（G）和丁香基（S）两种结构单元构成,它们在苯环上分别具有一个或两个甲氧基,因此脱甲基生成二醇是天然碳循环以及新兴生物技术中利用木质素的关键反应。本课题综合利用蛋白功能定向进化与双功能小分子（DFSM）结构调控的策略,基于细胞色素P450BM3开发了H2O2依赖型人工脱甲基酶,能够催化木质素芳香醚单体衍生物的脱甲基化。该生物体系构造简单,不需要电子传递蛋白和辅酶,在一定程度上克服以往脱甲基酶底物范围较窄、选择性不足、伴侣蛋白及NAD（P）H依赖等方面的缺点,为木质素的生物降解提供一种新的手段。研究结果分述如下:建立P450BM3突变体文库。根据拟突变位点设计引物,然后以p ET-28（a）-P450BMP（P450BMP为P450BM3的血红素结构域）为模板,对87位苯丙氨酸（Phe）和268位苏氨酸（Thr）进行定点突变,获得包括F87G、F87A、F87V、F87G/T268I、F87G/T268V、F87G/T268A、F87G/T268G、F87A/T268I、F87A/T268V、F87A/T268A共10种细胞色素P450 BM3的单/双突变体的文库。P450BM3及突变体的表达纯化。IPTG诱导表达并收集菌体,所得菌体经超声破碎、离心后重悬、His TrapTMHP柱亲和层析、透析、超滤等方式进行纯化,得到电泳纯P450BMP及突变体蛋白,根据P450BM3的特征吸收峰对所得目标蛋白进行表征,并用根据Hemochrome binding assay法计算蛋白浓度。P450BM3过加氧酶催化体系的建立。以F87A/T268I+Im-C6-Phe催化苯甲醚脱甲基化反应为例,降低助溶剂比例,并从底物浓度、H2O2浓度、DFSM浓度和反应时间4个因素进行条件优化,并将所得体系应用于WT及其他突变体,之后对不同链长小分子Im-C5-Phe和Im-C6-Phe的适配能力进行了比较。分析发现,DFSM的存在可有效激活P450BM3过加氧酶的脱甲基化活性,且Im-C6-Phe的适配性更强,对比WT及突变体的催化TON可知,87位氨基酸残基的大小及268位氨基酸的疏水作用力强弱对P450BM3过加氧酶的催化活性和选择性具有明显的影响。P450BM3过加氧酶催化不同木质素芳香醚单体衍生物的脱甲基化反应。将Im-C6-Phe驱动的P450BM3过加氧酶体系的底物范围拓展至2-甲氧基甲苯、愈创木酚、2-乙氧基苯酚、邻苯二甲醚和2,6-二甲氧基苯酚。比较发现,与苯甲醚相似,除了2,6-二甲氧基苯酚外,在没有DFSM的情况下,这些反应几乎没有脱甲基化产物生成（TON<10）。加入Im-C6-Phe后,各底物的脱甲基化TON均有明显提升,其中对愈创木酚显示出优异的催化活性和选择性,对2,6-二甲氧基苯酚也表现出一定的活性,表明该体系具有降解木质素的巨大潜力,尤其对G型木质素的降解。与愈创木酚、2-甲氧基苯酚、苯甲醚相比,邻苯二甲醚、2-乙氧基苯酚、2,6二甲氧基苯酚的催化TON明显较低,这可能是由于后三者的体积较大,不利于底物进入血红素活性口袋。总之,该体系对木质素芳香醚单体衍生物显示出良好的催化能力,但具有一定的底物适用范围。