论文部分内容阅读
近年来,随着表观遗传学的发展,Jumonji蛋白家族(JmjC-domain-containingproteins)的许多成员相继被鉴定为组蛋白赖氨酸去甲基化酶(histone lysinedemethylase,KDM),它们是染色质伴随蛋白(chromatin-associated protein),在染色质水平调控基因的转录与其它过程。Hairless(Hr)是这个家族中的一个成员,生物信息学分析显示HR不太可能是一个组蛋白赖氨酸去甲基化酶。但是令人瞩目的是,Hr基因的点突变在人和小鼠都会导致毛发的生长缺陷,表明HR蛋白有着重要的生物学功能。有报道表明HR参与调控核受体(nuclear receptor)2 VDR、TR等的靶基因及与WNT通路功能相关,但其中的作用机制并不明确。已知VDR的表达缺陷和WNT通路的功能异常也会导致毛发的生长缺陷,因此阐明HR与核受体VDR及WNT通路的功能关系,将有助于为这类疾病的治疗提供生化依据。HR蛋白在细胞内作用方式的阐明对解析Jumonji家族其它蛋白的功能亦会有所帮助。
本文主要探讨了HR对核受体VDR靶基因的调控方式,并简单观察了HR对WNT通路的作用。
1.通过RT-PCR在mRNA水平检测了Hairless基因在几种人的不同组织来源的细胞系的表达,发现HR在皮肤来源的细胞系如HaCaT和HeLa细胞及神经来源的细胞系如SH—SY5Y细胞表达较高,在人胚肾细胞293T亦有表达,在横纹肌来源的RD细胞几乎不表达。
2.免疫荧光显示在293T细胞,外源表达的flag-HR主要分布在细胞核内,而且不是均匀分布的。构建了全长的人HR与EGFP的融合表达质粒,在MCF7和293T细胞内观察到,在细胞分裂间期,HR在细胞核内表现为三种分布状态,均匀分布、完全的点状和介于两者之间的形态；在分裂期,HR的分布状态与纺锤体形状颇为相似,表现为在细胞核外的两个对称位置有荧光信号的密集分布,并且两者之间有点状的荧光信号连接。
3.克隆了人和大鼠的CYP24A1启动子,发现在HeLa细胞中过表达HR对人和大鼠的CYP24A1启动子活性均有抑制作用,并且在用不同浓度的1,25(OH)2D3诱导或不加药诱导时,抑制作用均存在。
4.克隆了人的RARB启动子,发现在HeLa细胞中过表达HR对RARB启动子的活性有较小的激活作用,这种作用在用10uM的ATRA诱导或不用药诱导时均存在。
5.通过对大鼠的CYP24A1启动子的删切实验,发现HR对CYP24A1启动子活性的抑制与VDRE序列密切相关。
6.免疫共沉淀实验提示HR与VDR蛋白之间有相互作用。
7.HeLa细胞中双荧光报告实验显示,20nM trichostatin A(TSA,Ⅰ和Ⅱ类HDAC抑制剂),20mM Nicotinamide(NAM,Ⅲ类HDAC抑制剂)、20uM adenosinedialdehyde(Adox,甲基转移酶的间接抑制剂)和10uM5-Aza-2’-deoxycytidine(5-Aza-dC,DNA甲基化的抑制剂)均不能解除HR对CYP24A1启动子活性的抑制作用,提示HR的功能不是通过改变组蛋白的乙酰化修饰,或者组蛋白和DNA的甲基化修饰实现的。
8.染色质免疫共沉淀实验显示,HR在HeLa细胞的高表达没有改变CYP24A1启动子的转录起始点(-83/142)和上游(-1056/-863)区域组蛋白H3K4Me3、H3K9Me3、H3K27Me3、H3K4Me2的修饰状态,进一步证明了HR的功能不是通过改变组蛋白的甲基化修饰实现的。
9.免疫共沉淀实验提示在HeLa细胞,外源表达的HR与内源的核受体共抑制蛋白NcoR1(nuclear receptor corepessor)、msin3A蛋白有相互作用；荧光显微镜观察到EGFP-HR与Cherry-NcoR1(756-2528aa)在293T细胞内的亚细胞定位一致;HR的免疫共沉淀蛋白的质谱数据中NcoR的肽段覆盖率为13％,三者结合可以提示HR与NcoR1蛋白在一个复合体中。
10.激光共聚焦显微镜观察到EGFP-HR与Cherry-ASH2L和Cherry-HP1α在293T细胞核内的定位呈互补分布,提示HR与ASH2L蛋白(被认为常常结合于活化的染色质区)和异染色质蛋白HP1α在细胞核内分布于不同的区室。
11.EGFP-HR与Cherry-VDR在293T和MCF7的亚细胞定位一致,结合以上结果,提示了HR对VDR的靶基因的抑制作用的可能机制。
12.克隆了WNT通路的靶基因cyclinD1和c-myc的启动子,双报告实验显示HR对cyclinD1和c-myc的启动子活性没有明显影响；HR对人工构建的WNT通路报告基因super TOPflash有较低的激活作用,在用或不用5-20mM LiCl(GSK3β的抑制剂,可以模拟wnt激活信号)处理时这种激活作用均存在。