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癫痫是一种常见的、严重的慢性神经系统性疾病,发病率高、难治愈。随着疾病的发生发展,患者还需忍受焦虑抑郁、智力减退、记忆力下降等共病症状的折磨,给社会及家庭带来极其沉重的负担。酸敏感离子通道1a（Acidsensing ion channel 1a,ASIC1a）是一类质子门控阳离子通道,因其在中枢神经系统的分布和钙离子渗透的特点,已成为包括癫痫、疼痛、恐惧、卒中等疾病的生理病理过程中备受关注的靶点。ASIC1a与癫痫的发生发展存在着密切联系,但其在癫痫中的具体作用及调控机制还存在争议。本研究在课题组前期的工作基础上,利用颞叶癫痫（Temporal lobe epilepsy,TLE）患者颞叶脑组织石蜡切片、海人酸（Kainic acid,KA）杏仁核点燃的癫痫大鼠模型和谷氨酸（Glutamate,Glu）诱导的细胞损伤模型,验证TLE病理发生过程中ASIC1a的表达与分布改变,探究ASIC1a在神经元死亡中的作用,并探讨ASIC1a的调节机制。本研究共分为三个部分:实验一:ASIC1a在TLE患者、癫痫大鼠模型及细胞谷氨酸损伤模型中的表达分布目的:从临床标本、动物模型和细胞模型三个层次上验证ASIC1a在癫痫病理发生过程中的表达和分布改变。方法:（1）收集TLE患者脑组织切片石蜡标本及对照组标本;（2）构建KA杏仁核点燃动物模型并观察其行为学和海马组织病理学的改变;（3）构建Glu诱导原代皮层神经元细胞损伤模型;（4）采用免疫荧光染色、膜蛋白提取、线粒体提取、Western blot等技术对ASIC1a的表达进行定位和半定量分析。结果:（1）TLE患者颞叶皮层脑组织中Calponin3沿神经纤维排列紊乱,ASIC1a表达增多且出现明显的核周聚集;（2）KA杏仁核点燃动物模型发作率高,死亡率较低;（3）与患者标本类似,TLE大鼠脑切片荧光染色也显示出神经纤维排列紊乱,ASIC1a表达明显增多。Western Blot显示海马组织总蛋白和线粒体蛋白中ASIC1a相对表达量均呈现先增加后减少的趋势,在24h时达到高峰;线粒体蛋白与总蛋白ASIC1a表达量之比随着发作时间延长而逐渐升高;（4）原代皮层神经元谷氨酸模型中,Western Blot显示总蛋白ASIC1a随谷氨酸损伤时间延长而先减少后增加。细胞膜比细胞质ASIC1a表达量随时间延长也呈现出先减少后增加的趋势,提示ASIC1a可能向细胞膜转移增多。结论:从TLE患者颞叶脑皮层脑组织、大鼠KA杏仁核点燃模型和原代神经元细胞Glu损伤模型三个层次上验证了ASIC1a在癫痫中的表达升高,且存在从细胞质向细胞膜/线粒体转运。实验二:ASIC1a参与介导KA/Glu诱导的神经元损伤目的:探讨ASIC1a通过哪些病理过程参与介导了KA或谷氨酸诱导的神经元损伤。方法:（1）给予Pc Tx1阻断ASIC1a后,观察KA杏仁核点燃大鼠的行为学变化;（2）给予Pc Tx1阻断ASIC1a后,观察KA杏仁核点燃大鼠的海马组织病理学改变;（3）体外培养HT22细胞系,并制备Glu损伤模型;（4）给予Pc Tx1阻断ASIC1a后,荧光染色观察ASIC1a在Glu细胞损伤模型中的线粒体定位情况;（5）给予Pc Tx1阻断ASIC1a后,检测Glu细胞损伤模型的凋亡和自噬情况。结果:（1）KA杏仁核点燃大鼠中,给予Pc Tx1阻断ASIC1a使大鼠癫痫发作的程度和发生率略有降低,但无统计学差异,且病理学改变程度无明显差异;（2）Glu细胞损伤模型中,给予Pc Tx1阻断ASIC1a能减轻Glu造成的线粒体损伤;（3）Glu细胞损伤模型中,给予Pc Tx1阻断ASIC1a能减轻Glu造成的细胞凋亡和细胞自噬。结论:在动物和细胞水平上,阻断ASIC1a能够减轻KA/Glu所致的神经元损伤,发挥神经保护作用,并且其具体机制与线粒体损伤、细胞自噬和细胞凋亡相关;实验三:ASIC1a的调控机制目的:探讨谷氨酸诱导的神经元损伤过程中,哪些信号通路参与调控ASIC1a的表达和功能。方法:（1）体外培养HT22细胞系,并制备Glu细胞损伤模型;（2）观察不同时间点Rho在Glu细胞损伤模型中的表达情况;（3）Glu细胞损伤模型给予Rho激动剂/抑制剂后,观察ASIC1a与Rho荧光共定位变化;（4）Glu细胞损伤模型给予Rho激动剂/抑制剂后,观察ASIC1a表达和定位的改变;（5）Glu细胞损伤模型给予PI3K抑制剂后,观察ASIC1a表达和定位的改变。结果:（1）Glu细胞损伤模型中,Western Blot显示总蛋白Rho随谷氨酸损伤时间延长而先增加后减少、又再次增加。细胞膜比细胞质ASIC1a表达量随时间延长呈现出先减少后增加的趋势;（2）给予Rho激动剂后,ASIC1a与Rho荧光共定位增强,荧光示ASIC1a在膜分布增多,real-time PCR示ASIC1a的m RNA表达升高,Western blot示ASIC1a蛋白表达增多,细胞膜与细胞质ASIC1a表达量之比提高;（3）给予Rho抑制剂后,ASIC1a与Rho荧光共定位减弱,荧光示ASIC1a表达减少,real-time PCR示ASIC1a的m RNA表达降低,Western blot示ASIC1a蛋白表达减少,细胞膜与细胞质ASIC1a表达量之比降低;（4）给予ROCK抑制剂后,real-time PCR示ASIC1a的m RNA表达变化无统计学差异,Western blot示ASIC1a蛋白表达略减少;（5）给予PI3K抑制剂后,ASIC1a在m RNA和蛋白水平的表达均降低。结论:在HT22细胞Glu损伤模型中Rho/ROCK信号通路和PI3K信号通路参与对ASIC1a表达和定位的调控。