【摘 要】
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Ⅲ型干扰素（IFN-λ）具有较好的广谱抗病毒能力和免疫调节功能,一般在肠道等黏膜部位呈现高表达。猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV）和猪德尔塔冠状病毒（Porcine Deltacoronavirus,PDCoV）是引起仔猪腹泻病的重要肠道病原,严重困扰生猪产业健康发展。本研究在猪Ⅲ型干扰素（PoIFN-λ3）原核表达的基础上,进一步考察了其
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Ⅲ型干扰素（IFN-λ）具有较好的广谱抗病毒能力和免疫调节功能,一般在肠道等黏膜部位呈现高表达。猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV）和猪德尔塔冠状病毒（Porcine Deltacoronavirus,PDCoV）是引起仔猪腹泻病的重要肠道病原,严重困扰生猪产业健康发展。本研究在猪Ⅲ型干扰素（PoIFN-λ3）原核表达的基础上,进一步考察了其生物学活性以及在IPEC-J2细胞和肠道类器官中对PEDV和PDCoV病毒复制的影响,结果为Ⅲ型干扰素在临床中的应用奠定了基础。1.猪Ⅲ型干扰素（PoIFN-λ3）的原核表达及复性研究以poly（I:C）刺激IPEC-J2细胞的诱导培养后的总RNA为模板,获得猪IFN-λ3基因。通过软件预测了猪IFN-λ3的信号肽位置,设计特异性引物去除信号肽,构建了携带猪PoIFN-λ3成熟肽基因的重组表达质粒。经转化大肠杆菌Rosetta感受态细胞进行原核表达后,SDS-PAGE和Western blotting检测分析,重组PoIFN-λ3蛋白成功表达,大小约为27 kDa,且以包涵体形式存在。通过蛋白的变性、复性、去除内毒素,获得了复性后的重组PoIFN-λ3蛋白,蛋白表达量为2.78μg/mL。将复性后的重组PoIFN-λ3蛋白免疫新西兰大白兔,制备了兔抗PoIFN-λ3多抗,ELISA检测血清效价为1:256000。经氨基酸序列比对,PoIFN-λ1与PoIFN-γ3氨基酸同源性为66%;Western-blot鉴定,重组PoIFN-λ3蛋白具有良好的反应性,且PoIFN-λ1与PoIFN-λ3存在交叉反应性。2.猪Ⅲ型干扰素在IPEC-J2和猪肠道类器官上抗病毒效果研究通过CCK-8法用0-4μg/mL变性、纯化、复性后的PoIFN-λ3重组蛋白刺激IPEC-J2细胞12 h,重组蛋白对IPEC-J2的细胞活力无显著影响。用终浓度为0.1、1、2μg/mL的复性后PoIFN-λ3重组蛋白刺激IPEC-J2细胞6、12、18、24 h检测干扰素刺激基因水平,结果显示ISG-15、OAS1、MX-1、IFIT1、IFIT3、IFITM1和IFITM3等干扰素刺激基因（ISGs）表达均显著上调,且在12 h达到峰值（p<0.001）。在IPEC-J2细胞和猪肠道类器官分别感染PEDV和PDCoV病毒时,用PoIFN-λ3重组蛋白预处理、同时处理和感染后处理三种方式观察病毒增殖情况,与对照组相比,PEDV和PDCoV病毒拷贝数均显著下降（p<0.05）,以1μg/mL终浓度预处理12 h方式抑制效果最明显。上述结果表明,变性、纯化、复性后的PoIFN-λ3重组原核表达蛋白具有较好的生物活性,不仅可以诱导IPEC-J2细胞干扰素刺激基因表达的上调,在IPEC-J2细胞和猪肠道类器官中也可以抑制PEDV和PDCoV的复制,且以预处理方式抑制效果最佳,为仔猪病毒性腹泻的防治提供了理论基础。
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