背景三阴性乳腺癌(Triple-negative breast cancer,TNBC)的发病率约占新诊断乳腺癌的1 5%-20%,发病年龄早,组织学分化差,生长非常活跃。由于雌激素受体、孕激素受体和人表皮生长因子受体2均阴性,故TNBC患者不能从内分泌和靶向治疗中获益。化疗在TNBC的治疗中,占据十分重要的地位。目前TNBC最常用的一线化疗药物包括蒽环类、紫杉醇、顺铂及5-氟尿嘧啶类。虽然TNBC患者接受了强烈化疗,但由于肿瘤本身的高度恶性及其对药物的耐药性,但TNBC患者的临床治疗效果并不理想。除了常规的化疗药物之外,肿瘤的治疗还可以使用免疫调节剂增强化疗效果。来那度胺是一种免疫调节剂,不仅可以调节免疫,还可以诱导肿瘤细胞凋亡和抑制血管新生。来那度胺在多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征中己经取得了很好的的治疗效果。近年研究显示,来那度胺对部分实体肿瘤如结直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌也有一定的疗效。另外,来那度胺还可增强化疗药物在前列腺癌、结直肠癌中的作用。但来那度胺在乳腺癌中的研究非常少,仅限于细胞水平上。研究报道,来那度胺联合维生素D可以诱导人TNBC细胞MDA-MB-231的凋亡,但对MDA-MB-231增殖无明显抑制作用。目前尚无来那度胺联合化疗药物对人TNBC细胞MDA-MB-231增殖抑制和凋亡的研究。乳腺癌的发生伴随大量血管的新生。抗血管生成的治疗,可抑制乳腺癌转移灶的部分生长。因此,抗肿瘤血管生成在乳腺癌的治疗中有一定的价值。肿瘤的血管新生是比较复杂的过程,其中,血管内皮细胞的增殖、迁移是肿瘤血管生成中非常关键的步骤之一。而由于血管内皮细胞基因稳定、不易耐药,因此抑制血管内皮细胞增殖、迁移的治疗,是抗肿瘤血管生成治疗的策略之一。来那度胺除诱导人TNBC细胞MDA-MB-231凋亡外,还可以作用于血管内皮细胞,抑制血管内皮细胞迁移,从而抑制肿瘤血管新生。化疗药物在大剂量、长间歇的给药模式下,主要杀死肿瘤细胞,对肿瘤血管的抑制作用比较弱。但近年研究显示,化疗药物在小剂量、长疗程、短间歇的给药模式下也可以抑制血管内皮细胞增殖、迁移,抑制肿瘤血管的新生。并不是所有的化疗药物都适合用于抑制血管新生的治疗。只有化疗药物抑制血管内皮细胞剂量低于对肿瘤细胞的细胞毒剂量时,才适合被用于抑制血管新生的治疗。阿霉素、紫杉醇、顺铂及5-氟尿嘧啶四种化疗药物哪种药物适合用于抑制TNBC血管新生治疗尚有争议。来那度胺、化疗药物均可以作用于肿瘤细胞和血管内皮细胞,但来那度胺的作用机制又与普通的化疗药物不同,提示来那度胺与化疗药物联合对肿瘤可能有协同抑制作用。来那度胺联合化疗药物的治疗方式有可能成为TNBC治疗的新模式。但目前尚无来那度胺联合阿霉素、紫杉醇、顺铂及5-氟尿嘧啶对人TNBC细胞MDA-MB-231增殖、凋亡和血管内皮细胞增殖、迁移作用的研究,亦无来那度胺联合化疗药物在TNBC动物水平上的研究。目的本研究通过对肿瘤细胞、血管内皮细胞和小鼠模型的研究,在细胞、动物两个水平上,观察来那度胺单药及联合化疗药物对TNBC生长抑制的作用。在肿瘤细胞水平上,选择人TNBC细胞MDA-MB-231作为研究对象;在血管内皮细胞水平上,选择人脐静脉内皮细胞(Human Umvilical Vein Endothelial Cell,HUVEC)作为研究对象。观察来那度胺联合TNBC一线化疗药物(阿霉素、紫杉醇、顺铂及5-氟尿嘧啶)分别对MDA-MB-231细胞增殖、凋亡的作用和对HUVEC细胞增殖、迁移的作用。比较化疗药物单药及与来那度胺联合对MDA-MB-231细胞和HUVEC细胞增殖抑制的差异,比较MDA-MB-231细胞和HUVEC细胞对化疗药物敏感性差异,筛选出既与来那度胺有协同作用,又适合用于抑制血管新生的化疗药物。并观察药物对MDA-MB-231细胞增殖、凋亡和对HUVEC细胞增殖、迁移通路关键蛋白的影响。同时构建人三阴性乳腺癌MDA-MB-231裸鼠皮下移植瘤模型,在动物水平观察来那度胺联合筛选出的化疗药物对肿瘤生长抑制的作用,并观察药物对肿瘤组织增殖、凋亡及微血管密度的变化,初步探讨来那度胺增强化疗药物抑制三阴性乳腺癌生长作用的机制。方法1.用MTT方法检测药物对MDA-MB-231细胞增殖能力的影响。将不同浓度来那度胺、化疗药物(阿霉素、紫杉醇、顺铂和5-氟尿嘧啶)及其联合,分别与MDA-MB-231细胞作用24 h,48 h和72 h,观察药物对MDA-MB-231细胞增殖的抑制作用。根据来那度胺与四种化疗药物的联合作用结果,筛选出来那度胺能增效的化疗药物。2.用流式细胞术方法检测药物对MDA-MB-231细胞凋亡的影响。将来那度胺、筛选出的化疗药物及其联合,与MDA-MB-231细胞作用72 h,观察药物对MDA-MB-231细胞凋亡的影响。3.用Western Blot方法检测蛋白表达。将来那度胺、筛选出的化疗药物及其联合,与MDA-MB-231细胞作用72 h,观察药物对MDA-MB-231细胞pERK、Bc1-2和Caspase-3蛋白表达的影响。4.用MTT方法检测药物对HUVEC细胞增殖能力的影响。将不同浓度来那度胺、筛选出的化疗药物,分别与HUVEC细胞作用24 h,48 h和72 h,观察药物对HUVEC细胞增殖抑制的作用。5.第二次筛选化疗药物。从第一次筛选出的化疗药物中,再根据化疗药物对MDA-MB-231细胞和HUVEC细胞增殖抑制曲线,筛选出对HUVEC细胞更敏感的化疗药物。6.用MTT方法检测药物对HUVEC细胞增殖能力的影响。将来那度胺及第二次筛选出的化疗药物与HUVEC细胞作用72 h,观察两者联合对HUVEC细胞增殖的抑制作用。7.用细胞划痕方法检测药物对细胞迁移的影响。来那度胺、第二次筛选出的化疗药物及其联合,在1%EGM2培养基下培养HUVEC细胞24 h,观察药物对HUVEC细胞迁移的影响。8.用Western Blot方法检测蛋白表达。来那度胺、第二次筛选出的化疗药物及其联合,与HUVEC细胞作用72 h,观察药物对HUVEC细胞pAkt蛋白的影响。9.建立三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞裸鼠皮下移植瘤模型。将30只裸鼠随机分为6组,每组5只。PBS组(向腹腔注射PBS,10 mg/kg,每天一次,连续用14天);LEN组(向胃灌注LEN,25 mg/天,连续用14天);5 mg/kg5-FU组(向腹腔注射5-FU,5 mg/kg,每天一次,连续用14天);25 mg/kg 5-FU组(向腹腔注射5-FU,25 mg/kg,每天一次,连续用5天);LEN+5 mg/kg 5-FU组(向胃灌注LEN,25 mg/天,连续用14天;并向腹腔注射5-FU,5 mg/kg,每天一次,连续用14天);LEN+25 mg/kg 5-FU组(向胃灌注LEN,25 mg/天,连用药14天;并向腹腔注射5-FU,25 mg/kg,每天一次,共用5天)。各组裸鼠给药28天后处死,观察各组肿瘤组织体积的变化,并绘制肿瘤生长曲线。并运用免疫组化方法检测肿瘤组织Ki67表达、微血管密度的情况,用TUNEL方法检测药物对肿瘤组织凋亡的影响。用Western Blot方法检测肿瘤组织pERK、Bc1-2和Caspase-3蛋白表达的变化。结果1.来那度胺、化疗药物及其联合对MDA-MB-231细胞增殖抑制作用MTT结果显示,来那度胺单药对MDA-MB-231细胞增殖无抑制作用。四种化疗药物阿霉素、紫杉醇、顺铂及5-氟尿嘧啶对MDA-MB-231细胞增殖均有明显抑制作用,而且均呈剂量和时间依赖性。并且来那度胺可以增强顺铂及5-氟尿嘧啶对MDA-MB-231细胞增殖抑制作用,但不能增强阿霉素、紫杉醇对MDA-MB-231细胞增殖抑制作用。2.来那度胺、化疗药物及其联合对MDA-MB-231细胞凋亡的影响流式细胞术结果显示,来那度胺、顺铂均能诱导MDA-MB-231细胞凋亡。联合组,与顺铂组比较,MDA-MB-231细胞凋亡率明显升高。流式细胞术结果显示,5-氟尿嘧啶能诱导MDA-MB-231细胞凋亡。联合组,与5-氟尿嘧啶组比较,MDA-MB-231细胞凋亡率明显升高。3.来那度胺、化疗药物及其联合对MDA-MB-231细胞pERK、Bc1-2和Caspase-3蛋白表达的影响Western Blot结果显示,来那度胺降低MDA-MB-231细胞的pERK蛋白的表达,顺铂上调MDA-MB-231细胞pERK蛋白的表达。联合组,与顺铂组比较,pERK蛋白表达明显下降。来那度胺、顺铂均能下调MDA-MB-231细胞Bc1-2蛋白表达,上调MDA-MB-231细胞Caspase-3蛋白表达;联合组,与顺铂组比较,Bcl-2蛋白表达进一步下降和Caspase-3蛋白表达进一步升高。Western Blot结果显示,5-氟尿嘧啶上调MDA-MB-231细胞pERK蛋白的表达。联合组,与5-氟尿嘧啶组比较,pERK蛋白的表达明显下降。5-氟尿喃啶能下调MDA-MB-231细胞Bcl-2蛋白的表达,并上调MDA-MB-231细胞Caspase-3的表达;联合组,与5-氟尿嘧啶组比较,Bcl-2蛋白表达进一步下降,Caspase-3的表达进一步升高。4.来那度胺、化疗药物对HUVEC细胞增殖抑制作用来那度胺对HUVEC细胞无明显增殖抑制作用。而顺铂、5-氟尿嘧啶对HUVEC细胞增殖有明显抑制作用,而且呈剂量和时间依赖性。5.MDA-MB-231、HUVEC细胞对顺铂及5-氟尿嘧啶敏感性差异同样浓度的顺铂对MDA-MB-231细胞抑制率明显高于HUVEC细胞,提示MDA-MB-231细胞对顺铂更敏感;同样浓度的5-氟尿嘧啶对HUVEC细胞的抑制率明显高于对MDA-MB-231细胞,提示HUVEC细胞对5-氟尿嘧啶更敏感。结果提示,5-氟尿嘧啶适合用于抑制血新生的治疗。6.来那度胺联合5-氟尿嘧啶对HUVEC细胞增殖的抑制作用MTT结果显示,来那度胺联合5-氟尿嘧啶组,与5-氟尿嘧啶单药组比较,对HUVEC细胞增殖抑制作用更明显。7.来那度胺联合5-氟尿嘧啶对HUVEC细胞迁移的抑制作用细胞划痕实验结果显示,来那度胺、5-氟尿嘧啶单药均能抑制HUVEC细胞的迁移,而且来那度胺可以增强5-氟尿嘧啶对HUVEC细胞迁移的抑制作用。8.来那度胺、5-氟尿嘧啶及联合对HUVEC细胞pAkt蛋白的影响Western Blot结果显示,来那度胺、5-氟尿嘧啶均能下调HUVEC细胞pAkt蛋白的表达;而两药联合与5-氟尿嘧啶组比较,可以进一步下调pAkt蛋白的表达。9.来那度胺、5-氟尿嘧啶及其联合对三阴性乳腺癌裸鼠移植瘤组织生长抑制作用30 只裸鼠均建瘤成功。LEN、5 mg/kg 5-FU、25 mg/kg 5-FU 及 LEN+5-FU组均能抑制三阴性乳腺肿瘤的生长。与PBS组比较,LEN组Ki67的表达没有明显下降,凋亡细胞数量增多,微血管密度降低。5 mg/kg 5-FU组对肿瘤组织Ki67表达没有影响,凋亡细胞数量轻微升高,微血管密度降低。25 mg/kg 5-FU组,肿瘤组织Ki67表达明显下降、凋亡细胞数量明显增加,微血管密度明显下降。LEN+5-FU组,与5-FU组比较,肿瘤组织Ki67表达进一步降低,凋亡细胞数量进一步升高,微血管密度进一步降低。Western Blot结果显示,与PBS组比较,LEN组中pERK蛋白明显下降,Bcl-2蛋白下降和Caspase-3蛋白升高;5 mg/kg 5-FU组中pERK蛋白轻微升高,Bcl-2蛋白轻微下降和Caspase-3蛋白轻微升高;25 mg/kg 5-FU组中pERK蛋白明显升高,Bcl-2蛋白明显下降和Caspase-3蛋白明显升高;LEN+5-FU组,与5-FU组比较,pERK蛋白明显下降,Bcl-2蛋白明显下降和Caspase-3蛋白明显升高。结论1.来那度胺可以通过诱导人三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231凋亡,抑制人血管内皮细胞HUVEC的迁移,抑制三阴性乳腺癌的生长。2.在阿霉素、紫杉醇、顺铂和5-氟尿嘧啶四种化疗药物中,来那度胺可以增强顺铂、5-氟尿嘧啶对人三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖抑制作用;其中,5-氟尿嘧啶适合用于抑制血管新生的治疗,同时来那度胺可以增强5-氟尿嘧啶对血管内皮细胞HUVEC增殖和迁移作用。3.来那度胺通过降低pERK、Bcl-2蛋白的表达,升高Caspase-3蛋白的表达,并降低微血管密度来增强5-氟尿嘧啶对三阴性乳腺癌的生长抑制的作用。