食淀粉乳杆菌联合芦丁干预PoRV感染致紧密连接蛋白及其相关细胞因子的研究

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猪轮状病毒(Porcine Rotavirus,PoRV)是导致哺乳仔猪出现严重腹泻的病原之一,通过感染肠上皮细胞,破坏细胞间的紧密连接,造成肠道损伤。食淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorus)可以在肠道定植并形成稳定菌群,已知是食淀粉乳杆菌及其分泌上清可以抑制病原体引起的上皮完整性破坏,保护肠黏膜细胞。许多研究表明从植物性食物中发现的多酚能够提高机体的免疫能力具有抗病毒、抗氧化、抗肿瘤等生物活性。本研究旨在通过益生菌联合多酚共同对抗PoRV感染,观察益生菌和多酚干预PoRV感染肠道组织的作用,为今后研发防治猪轮状病毒感染相关微生物结合多酚制剂建立理论基础。本研究前期通过CCK-8法检测病毒抑制率,利用食淀粉乳杆菌和芦丁干预PoRV感染IPEC-J2细胞和乳鼠,试验结果显示,在细胞实验中48 h时各组病毒含量表现为轮状病毒感染组(RV组)>芦丁预防组(LR组)>食淀粉乳杆菌分泌上清预防组(SR组)>食淀粉乳杆菌分泌上清联合芦丁预防组(SLR组);ZO-1 mRNA相对表达量表现为SLR组>SR组>LR组>RV组,Occludin mRNA相对表达量表现为SLR组>LR组>SR组>RV组,RV组Claudin-4 mRNA相对表达量仅在24h时明显高于Control组,且均低于其他预防组,表现为SLR组>LR组>SR组>RV组。在乳鼠实验中所有预防组乳鼠粪便中的病毒含量均低于RV组,表现为:轮状病毒感染组(RV组)>芦丁低剂量预防组(LR组)>食淀粉乳杆菌预防组(SR组)>食淀粉乳杆菌分泌上清结合低剂量芦丁预防组(SLR组)>芦丁高剂量预防组(HR组)。通过空肠绒毛形态学观察,RV组乳鼠空肠绒毛出现排列紊乱、绒毛缩短并脱落等病理变化,而其他预防组乳鼠空肠绒毛的损伤情况与RV组相比均有明显改善。RV组的ZO-1和Occludin mRNA相对表达量、蛋白表达量明显低于其他组,整体表现为SLR组>HR组>LR组>SR组>RV组,Claudin-4 mRNA相对表达量和蛋白表达量明显高于其他预防组,且在肠道组织中呈现分布不均的现象,SR组、LR组、HR组和SLR组均可以降低Claudin-4 mRNA相对表达量和蛋白表达量,且各组肠道组织内Claudin-4蛋白的分布没有受到影响,HR组乳鼠肠组织中的Claudin-4蛋白分布情况与Control组无显著差异。通过测定每一个分组中乳鼠肠组织的氧化还原指标,结果显示Control组的MDA、T-SOD、T-AOC含量整体没有明显变化;RV组的MDA的含量明显高于Control组及预防组,而TSOD和T-AOC含量则低于Control组及预防组;SR组的MDA含量低于LR组,而高于HR组和SLR组,SR组的T-SOD和T-AOC含量高于LR组,而低于HR和SLR组;HR组的MDA、T-SOD、T-AOC含量均呈现下降趋势。通过测定每一个分组中乳鼠肠组织中的细胞因子含量,结果显示Control组的胰蛋白酶含量整体水平没有明显变化,PAR-2含量呈上升趋势;RV组的胰蛋白酶和PAR-2含量均高于Control组及预防组,呈上升趋势;SR组的胰蛋白酶和PAR-2含量均低于LR组且高于HR组和SLR组,呈上升趋势。Control组的TGF-β和MMP-9含量整体没有明显变化;RV组的TGF-β和MMP-9含量均高于Control组及预防组;SR组的TGF-β含量低于RV组且高于其他组,整体呈先下降后升高的趋势,MMP-9含量均高于其他预防组,整体呈下降趋势;LR组的TGF-β含量低于高于HR组且整体呈下降趋势,MMP-9含量整体无显著变化且与Control组差异不大;SLR组的TGF-β含量低于SR组且呈现上升趋势,MMP-9含量低于SR组且整体呈现下降趋势;HR组的TGF-β含量整体无显著变化且最低,MMP-9含量呈下降趋势且最低。综上所述,食淀粉乳杆菌分泌上清和芦丁干预均可修复因PoRV感染造成的细胞损伤及紧密连接蛋白表达和分布不均,芦丁在干预PoRV感染细胞和肠道组织作用上存在浓度依赖性,且低浓度芦丁可与食淀粉乳杆菌协同作用,增强干预PoRV感染的能力,食淀粉乳杆菌和芦丁均可以降低PoRV感染时的MDA、胰蛋白酶、PAR-2、TGF-β和MMP-9含量,提高T-SOD和T-AOC含量,增强抗氧化能力,减轻PoRV对肠上皮细胞的损伤,本研究为预防PoRV感染提供了借鉴,为益生菌和多酚联合使用奠定了一定的理论基础。
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