目前,人类同种器官移植面临着供体器官短缺的问题。异种移植被认为是解决该问题的有效途径之一。猪与人在解剖学、生理学和生化指标等方面与人极其相似,使其成为人类异种移植供体来源的理想动物。然而,在实现异种移植之前,必须解决物种间的免疫屏障问题。异种移植最大障碍在于体液免疫,表现为超急性排斥反应和延缓性排斥反应。α1,3-GT基因敲除猪研制成功后,超急性排斥反应已基本得到克服,延缓性排斥反应作为异种器官移植的另一道必须克服的障碍已成为全世界异种移植研究的热点。转录因子NF-κB在延缓性排斥反应中发挥着重要的作用。IκBα是NF-κB的重要抑制因子。然而,IκBα可在炎性介质的刺激下被磷酸化而降解,从而导致NF-κB的激活。于是研究者找到了IκBα的一个突变体,可有效抵抗磷酸化。由于NF-κB信号转导在脊椎动物的生长和发育过程中起着关键的作用,在供体动物的胚胎时期就将IκBα突变体取代其野生型是不可行的。因此,针对猪IκBα的条件打靶是一个较好的选择。本研究的最终目的就是实现IκBα野生型及突变型在基因组水平的可控表达。本研究成功构建了一系列猪IκBα打靶载体,其中包括条件性打靶载体pFPC-C、pLHG-5、pLHG-6和普通敲除载体pLHG-4。本研究的最终目的就是实现IκBα野生型及突变型在基因组水平的可控表达。对中靶PIEC(猪血管内皮细胞系)的表型分析在一定程度上可作为预测个体水平变化的一个良好模型。具体研究结果如下：1.5’短臂的扩增及克隆以猪PIEC基因组DNA为模板,在猪IκBα基因转录起始位点上游设计引物,扩增并克隆到2.0kb片段。2.3’长臂的扩增及克隆以猪PIEC基因组DNA为模板,在猪IκBα基因第二外显子下游设计引物,扩增并克隆到6.0kb片段。3.猪IκBα基因定点诱变首先采用Stratagene公司单点突变试剂盒将猪IκBα基因32位丝氨酸位点突变为丙氨酸,接着试图在36位引入突变但未成功,最后改用重叠延伸PCR对36位进行突变。结果表明,两种突变方法结合使用,成功地将猪IκBα基因32、36位丝氨酸位点突变为丙氨酸。4. IκBα野生型及突变型真核表达载体构建及真核表达实验以pcDNA3.1(+)为骨架构建IκBα野生型及突变型真核表达载体pcDNA3.1-Loxp-IκBα、pcDNA3.1-Loxp-mIκBα,并转染猪肾细胞PK15, RT-PCR检测结果表明上述两个表达框是有效的。5.含有突变型和野生型IκBαcDNA序列的Cre/Loxp系统构建及验证将IκBα完全表达框CMV-Loxp-IκBα-pA、正负筛选融合基因Tkneo、mIκBα非表达无启动子结构Loxp-mIκBα-pA顺序连接,获得含有突变型和野生型IκBαcDNA序列的Cre/Loxp系统,并在PIEC细胞中验证了该系统的有效性。6. pFPC-C条件性打靶载体构建将含有突变型和野生型IκBαcDNA序列的Cre/Loxp系统、5’短臂、3’长臂构建到打靶用载体pFPC-1中,获得IκBα时空特异性条件打靶载体pFPC-5’arm-CMV-Loxp-IκBα-pA-TKneo-Loxp-mIκBα-pA-3’arm (pFPC-C)。7.含内源启动子的条件打靶载体pLHG-5的构建将pFPC-C载体中的5’短臂和CMV启动子用IκBα内源启动子片段取代,即可获得含内源启动子的条件打靶载体pFPC-ITMFF-LA16-Swa I (pLHG-5).8.单独锚定筛选标记基因的条件打靶载体pLHG-6的构建经多轮亚克隆实验,在筛选标记基因Tkneo两端添加Flp重组酶识别位点以单独锚定该基因,获得条件打靶载体pFPC-ITM-LA16 (pLHG-6)。9.普通打靶载体pLHG-4的构建设计引物对SA6-F、SA6-R,以PIEC基因组DNA为模板,扩增1833bp的SA6片段。合成两条单链寡核苷酸SceF、SceR,经高温变性、低温退火,得25bp左右的短双链DNA即Sce短片段。pFPC-C载体双酶切插入SA6片段,得pLHG-1. pUC-2N载体双酶切插入Sce片段,得pUC-2-Sce (pUC-2S); pUC-2S载体双酶切插入EIN片段,得pUC-EIN。pUC-EIN载体双酶切得EIN片段,插入pLHG-1载体,得猪IκBα敲除载体pFPC-SA6-EIN-LA16 (pLHG-4)。10. pLHG-4基因打靶试验使用Amaxa核转仪及配套的哺乳动物内皮细胞核转试剂盒转染PIEC细胞。经比较选定效率最高的程序(T-023)进行pLHG-4转染实验。1mg/ml G418加压筛选10-14天提取基因组DNA,使用引物对PCRF3、PCRR3进行检测。本实验共获得G418抗性克隆1983个,所有克隆均呈现EGFP高表达。但未检测到PCR阳性克隆。近二十多年以来,NF-κB一直是诱导性转录因子的标准。NF-κB在免疫系统中发挥着种间高度保守的重要作用,它调控着针对各种病原的应答,即处于广阔网络交汇点的诱导因子和效应因子的表达。在NF-κB家族中,p65亚基至关重要。在含有TAD(转录激活区域)的三个亚基中,p65是唯一一个全身性表达的。p65亚基的缺失导致因肝变性所致胚胎死亡；相应的,缺失其它四个亚基中任何一个都仅仅导致免疫缺陷,并未表现出任何发育障碍。为了治疗炎症、自体免疫和移植排斥,有必要在维持p65抗凋亡功能的前提下抑制p65的活性。而p65RHD是一个较好的选择,它是将p65蛋白的DNA结合、核定位、二聚体化及结合IkB蛋白的区域(即Rel同源区)保留,将其它区域(主要是转录激活区域TAD)截去,从而获得一个截短型蛋白。过表达人P65RHD可抑制内皮细胞中促炎症基因的表达而不增加其对凋亡的敏感度。而在诸如炎症、慢性关节炎、同种和异种移植的病理条件下,内皮细胞的激活是一个常见现象。本研究对猪NFκB p65进行了全面的特征分析,并实现了猪p65RHD在猪血管内皮细胞系PIEC中的四环素可控表达。具体研究结果如下：1.pp65基因组结构分析将已公布的猪p65 CDS序列与猪HTG基因组DNA序列进行比对,推导出猪p65的外显子和内含子区域。pp65基因共有11个外显子,10个内含子。p65基因结构在人、小鼠和猪中是高度保守的。2.pp65的克隆、表达载体构建及序列分析分三段扩增到1704bp片段,即为pp65 CDS全长,双酶切克隆到哺乳动物表达载体pcDNA3.1(+)中,得到pp65过表达载体pcDNA3.1(+)-pp65。猪、牛、人、小鼠间多序列比对鉴定到pp65的三个主要功能域：Rel同源区(RHD)、转录激活区1(TAD1)和转录激活区2(TAD2)。另外,系统进化分析显示pp65与牛进化关系最接近。3.猪NFκB p65亚基的表达及特征分析将表达载体pcDNA3.1(+)-pp65及荧光素酶报告基因载体分别共转染PIEC、3D4/21和PFF细胞。pp65的过表达明显激活(P<0.01)报告基因载体pNF-κB-Luc的荧光素酶活性。使用抗人、大鼠和小鼠p65蛋白的商业化单克隆抗体来检测pp65及pp65RHD。结果表明,PIEC、3D4/21、PFF及PAEC四种细胞的pp65均主要定位于细胞质,在有效转入pp65表达质粒的PIEC、3D4/21、PFF细胞中可检测到强烈的pp65过表达,PIEC的pp65RHD过表达也是大部分位于细胞质中。4. pp65RHD的过表达抑制NFκB将含有pp65 cDNA5’末端996bp片段的哺乳动物表达载体pIRES2-EGFP-pp65RHD和荧光素酶报告基因载体共转染PIEC、3D4/21和PFF细胞。报告载体pNF-KB-Luc的荧光素酶活性被pp65RHD的过表达显著抑制(P<0.01)。将pIRES2-EGFP-pp65RHD、pcDNA3.1 (+)-pp65和荧光素酶报告基因载体共转染PIEC、3D4/21和PFF细胞。相对于只转染pp65的细胞,共转染pp65和pp65RHD的细胞中报告载体pNF-KB-Luc的荧光素酶活性急剧下降(P<0.05),表明pp65过表达所致NFκB激活受到pp65RHD的强烈抑制。5.猪pp65表达谱分析实时定量PCR分析表明,猪p65 mRNA水平的表达在不同组织中有明显的差别,肺、脾、肝和小肠中表达较高,肾、胃中表达量中等,心、背最长肌和腿肌中表达较低。6.SNP检测及关联分析经序列比对,检测到30多个多态位点。只选取位于第七外显子的同义SNP6382(T/C) (BglⅠ)和位于第八内含子7227bp处的8碱基对插入/缺失突变(NcoⅠ)作进一步研究。关联分析表明SNP BglⅠ与猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体水平(PRRSV-AB)(0日龄P=0.0116；17日龄P=0.0021)、猪瘟病毒抗体阻断率(CSFV-AB)(0日龄P=0.0028；17日龄P=0.0146)、伪狂犬病毒抗体水平(PRV-AB)(0日龄P=0.0282；32日龄P=0.0401)显著相关。7. pTet-ICAM载体构建经重叠延伸PCR获得2.4kb的ICAM-2启动子全长,取代pTet-on advanced载体中的CMV启动子,获得内皮细胞特异性表达rtTA的载体pTet-ICAM。8. pp65RHD四环素可控内皮细胞特异性表达及对NFκB的影响将pp65RHD四环素可控内皮细胞特异性表达系统中的质粒载体pTet-ICAM、pTRE-pp65RHD-IRES2-EGFP瞬时共转染PIEC细胞,24h后添加Dox诱导,再过24h在荧光显微镜下观察。结果表明,该系统表现出基底表达低、诱导表达明显的特点,初步说明该可控表达系统是切实有效的。经G418、潮霉素B (HygB)连续两次稳定筛选,依次将两个载体pTet-ICAM、pTRE-p65RHD-IRES2-EGFP整合到PIEC细胞的基因组中,从而实现pp65RHD四环素可控内皮细胞特异性稳定表达。选取其中较为典型的基底表达较低、诱导表达较高的7个单克隆27-6号、27-16号、27-19号、27-20号、27-21号、27-32号及27-34号用于后续试验。利用免疫组织化学技术检测27-20号、27-21号克隆pp65RHD蛋白水平的诱导表达。两个克隆的表达情况差异较大,27-21号单克隆p65RHD表达量较为均匀适中,27-20号单克隆pp65RHD表达呈集落状分布,局部表达很强且集中在细胞核中。使用NFκB报告载体法对本实验所得7个单克隆进行了检测。结果表明,pp65RHD的诱导表达不能抑制pp65过表达所致NFκB信号通路的激活,也不能抑制NFκB的基底活性。