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目的:本项研究观察蟾毒灵(Bufalin,BF)在异丙肾上腺素(Isoproterenol,ISO)诱导的小鼠心肌纤维化中的影响,并探讨其可能存在的分子机制。方法:采用6周龄、SPF级、雄性C57BL/6J小鼠40只(体重20±5g),室温下普通饲料适应性喂养7天后,随机分成以下4组:1)Control组,腹腔注射PBS连续3周;2)Bufalin组,腹腔注射BF 0.5mg/kg,隔天一次,连续3周;3)ISO组,腹腔注射ISO 10mg/Kg,连续2周;4)ISO+Bufalin组,腹腔注射3周Bufalin的同时包括2周的ISO。具体动物模型处理方案如图(B)所示。小鼠动物模型构建完成后,采用小动物超声仪检测、观察各组小鼠的心功能,检测指标有:左室射血分数(EF%)和缩短分数(FS%)。完成心功能检测后,处死小鼠,取小鼠心脏,用1*PBS缓冲液洗刷干净,吸干心脏多余水分,称量,及时记录相关数据,并计算心脏重量指数CWI。CWI为心脏重量(HW,mg)/体重(BW,g);采用H&E染色检测小鼠心脏组织病理学变化;Masson染色、天狼星红染色检测心肌胶原纤维沉积面积,观察小鼠心脏纤维化情况;采用TUNEL染色法检测细胞凋亡情况;小麦胚芽凝集素染色(WGA)测量心肌细胞面积,继而评估小鼠心肌细胞大小情况;蛋白免疫印迹(Western blot)检测心肌组织中Collagen Type I、Collagen Type III、Caspase-1、Bax、Bcl-2、TGF-β1、p-Smad2/3、Smad2/3的蛋白表达水平;q RT-PCR检测小鼠心肌组织中IL-6、IL-1β、Collagen Type I、Collagen TypeⅢ、ANP、BNP等基因的m RNA表达水平。结果:1.与CON组相比,ISO组小鼠心脏重量、心脏重量指数(CWI)明显升高,超声心动图结果显示EF%、FS%水平明显下降;而与ISO组小鼠相比,ISO+Bufalin组相关结果表明,在Bufalin处理之后,EF%、FS%水平明显升高,CWI水平明显下调。这说明,Bufalin可以改善ISO引起的小鼠心功能受损。2.H&E染色、蛋白免疫印迹及q RT-PCR检测结果表示,与CON组相比,ISO组小鼠的心脏炎性浸润情况加剧、炎症相关基因表达也升高;反之,与ISO组相比,ISO+Bufalin组中,由于Bufalin的处理,显著减轻了ISO诱发的心脏炎性反应。3.H&E染色、TUNEL染色、蛋白免疫印迹及q RT-PCR检测结果显示,与CON组比较,ISO组小鼠的心肌细胞凋亡情况加重,凋亡相关基因表达也升高;反之,与ISO组相比,ISO+Bufalin组中,由于Bufalin的处理,显著减轻了ISO诱发的心肌细胞凋亡情况。4.Masson染色、天狼星红染色、蛋白免疫印迹及q RT-PCR检测结果显示,与CON组比较,ISO组小鼠的心肌纤维化水平显著加重,纤维化相关基因表达也明显上调;反之,与ISO组相比,ISO+Bufalin组中,由于Bufalin的处理,显著改善了ISO诱发的心脏纤维化情况。5.小麦胚芽凝集素(WGA)染色、q RT-PCR检测结果显示,与CON组比较,ISO组小鼠的心肌细胞明显增大,心肌细胞肥大相关基因表达也明显上调;反之,与ISO组相比,ISO+Bufalin组中,由于Bufalin的处理,显著改善了ISO诱发的心肌细胞肥大。6.蛋白免疫印迹结果显示,与CON组比较,ISO组中通路蛋白TGF-β1、p-Smad2/3的表达水平明显上调,Smad2/3发生了磷酸化;与ISO组相比,ISO+Bufalin组中,由于Bufalin的处理,抑制了ISO诱发的TGF-β1、p-Smad2/3的表达水平,Smad2/3的磷酸化得到了抑制。结论:1.Bufalin可以改善ISO诱导的小鼠心功能减退和心肌纤维化水平;2.Bufalin改善心肌纤维化的机制是通过抑制ISO诱导的心脏炎症反应、抑制凋亡水平、抑制TGF-β1/Smads通路。