黄瓜（Cucumis sativus L.）是葫芦科甜瓜属的一种重要的园艺和经济作物,具有悠久的栽培历史。在生产中由于生物胁迫和非生物胁迫的存在,对栽培黄瓜的产量、品质都造成很大程度的影响,因此为保障黄瓜产量和品质需要不断进行选育黄瓜新品种。然而传统黄瓜育种方式由于其育种年限长、抗性基因较少、效率较低等因素,很难快速得到满足人们需求的优良品种。转基因技术是现代分子育种的重要手段,其在解析基因功能、基因工程育种以及基因组编辑等方面都发挥着重要作用。农杆菌介导的遗传转化法是黄瓜转基因技术中应用最为普遍和广泛的,但目前该方法的转化效率仍待进一步优化。本研究从农杆菌自身活力、共培养温度、农杆菌侵染液浓度和共培养时间等方面对农杆菌介导的黄瓜遗传转化体系进行优化,通过数据统计确定了最优转化条件。随着黄瓜研究在分子水平上的深入发展,越来越多具有重要功能的基因被定位并克隆出来,基因功能的研究也愈发重要。突变体与其相应的突变基因之间密切相关,可以直接有效的用于基因功能研究。而黄瓜因其遗传基础狭窄、自然变异频率很低,自发突变体的获得概率极低。因此人为创制突变体进行重要功能基因研究逐渐成为趋势。突变体创制方法包括物理诱变、化学诱变以及插入突变等多种方法,插入突变中的T-DNA插入突变具有可以研究无表型的基因、易得到插入突变位点、突变位点较少等多个优点,对于突变体的创制及基因功能研究较为适合。本研究利用GFP报告基因对黄瓜遗传转化体系进行优化,并进行黄瓜T-DNA插入突变体的创制工作。研究结果如下:1.农杆菌介导的黄瓜遗传转化体系优化在本实验室已经建立的农杆菌介导的黄瓜子叶节遗传转化体系的基础上,通过测定农杆菌C58的生长曲线,确定选取培养12～18 h的菌液制备侵染液。从共培养温度、共培养时间和农杆菌侵染液浓度等方面,对黄瓜遗传转化体系进行优化。结果发现,当共培养温度为23℃时,外植体再生率达到最高的31.70%,阳性诱导率达到最高的2.26%;将侵染液浓度和共培养时间联合处理,当侵染液OD值为0.1和共培养时间为7 d时,外植体再生率达到最高的40.13%,而不同处理的外植体阳性诱导率并没有显著差异。综上,本研究得到了选取培养12-18 h的菌液制备侵染液,共培养温度为23℃的优化的遗传转化体系。2.黄瓜T-DNA插入突变体的创制及快速鉴定利用优化的黄瓜遗传转化体系,以pGreen0029植物表达载体为T-DNA插入载体进行黄瓜T-DNA插入突变体的创制。利用GFP荧光鉴定、PCR和TAIL-PCR方法对T0代植株进行鉴定。利用GFP荧光观察在外植体分化阶段就开始进行阳性植株筛选,从2978个转化外植体中筛选出3株表达GFP信号的阳性芽;PCR鉴定结果表明T0代转化植株的基因组中整合了载体序列;利用TAIL-PCR方法进行T-DNA侧翼序列扩增,初步确定了突变体T-DNA-PG-1的T-DNA插入位点;根据T-DNA插入位点设计特异性引物进行PCR检测,对TAIL-PCR结果得到证实。综上,本研究得到了成功转入T-DNA载体的黄瓜突变体,并通过TAIL-PCR技术确定了黄瓜突变体T-DNA-PG-1的突变位点。