【摘 要】
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大熊猫繁育工作是大熊猫种群保护的重要环节,雌性大熊猫的发情鉴定和妊娠诊断技术是提高大熊猫繁殖率的关键所在。目前,大熊猫发情鉴定、输精时间的确定和妊娠诊断主要依赖于尿液雌激素和孕酮水平的检测。但国内目前尚缺乏用于大熊猫性腺激素检测的试剂盒。本研究旨在建立一种大熊猫尿液中雌二醇与孕酮的ELISA检测方法,为指导大熊猫繁殖工作,提高大熊猫繁育水平提供技术支撑。试验以E2-BSA和P4-BSA为免疫原,免
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大熊猫繁育工作是大熊猫种群保护的重要环节,雌性大熊猫的发情鉴定和妊娠诊断技术是提高大熊猫繁殖率的关键所在。目前,大熊猫发情鉴定、输精时间的确定和妊娠诊断主要依赖于尿液雌激素和孕酮水平的检测。但国内目前尚缺乏用于大熊猫性腺激素检测的试剂盒。本研究旨在建立一种大熊猫尿液中雌二醇与孕酮的ELISA检测方法,为指导大熊猫繁殖工作,提高大熊猫繁育水平提供技术支撑。试验以E2-BSA和P4-BSA为免疫原,免疫Balb/C小鼠,采用碳化二亚胺法合成了包被原E2-OVA和P4-OVA,制备并检测了雌二醇与孕酮抗体。同时,采用改良过碘酸钠法,以雌二醇-半琥珀酸酯为原料,将HRP标记于雌二醇小分子上;采用碳化二亚胺法,以孕酮-半琥珀酸酯为原料,将HRP标记于孕酮小分子上。初步建立了雌二醇间接竞争ELISA检测方法。试验结果如下:1.采用碳化二亚胺法合成了E2-OVA与P4-OVA,经紫外光谱扫描,合成物成功偶联,偶联比分别为53:1和18:1。在此基础上,建立了检测雌二醇与孕酮抗体的间接ELISA方法:包被原E2-OVA的最佳稀释度为1:2000,雌二醇抗血清最适稀释度为1:2000;包被原P4-OVA的最佳包被稀释度为1:4000,孕酮抗血清最适稀释度为1:16000;2.分别以E2-OVA与P4-OVA为抗原,免疫Balb/C小鼠,制备了孕酮与雌二醇抗体,经间接ELISA检测,雌二醇抗体效价为1:32000,孕酮抗体效价可达1:512000;3.采用改良过碘酸钠法,以雌二醇-半琥珀酸酯和辣根过氧化物酶为原料,将HRP标记于雌二醇;采用碳化二亚胺法,以孕酮-半琥珀酸酯为原料,将HRP标记于孕酮,制备了雌二醇和孕酮酶标抗原,经紫外光谱鉴定,证明酶标抗原的合成成功,同时经过直接ELISA检测,酶标抗原具有良好的免疫活性;初步建立了检测雌二醇的间接竞争ELISA方法,检测范围为39 ng/m L-1250 ng/m L。本研究建立的雌二醇、孕酮ELISA试剂盒为大熊猫尿液雌二醇与孕酮的检测提供了技术保障。
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