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目的:
本研究在已成功克隆pET24a-IP-10-SA重组表达质粒的基础上,拟制备出具有双功能活性的IP-10-SA融合蛋白(IP-10介导的对单核细胞的趋化功能以及SA介导的对已生物素化的肿瘤细胞MB49的锚定功能),为进一步对IP-10-SA双功能融合蛋白进行体内动物实验研究打下基础,同时也为IP-10表面锚定修饰的肿瘤细胞疫苗的研制打下基础。
方法:
1诱导表达IP-10-SA融合蛋白
用CaCl2方法制备Rosetta感受态细胞,将质粒pET24a-IP-10-SA(由本室保存)转化入感受态细胞中进行活化,通过优化IPTG诱导浓度、诱导时间等条件使得IP-10-SA得到高效表达,牧集工程菌,进行高压破菌,收集包涵体。应用SDS-PAGE分析检测表达产物。
2包涵体洗涤,纯化,复性
收集的包涵体经洗涤后用8M尿素溶解(PH8.0,4℃过夜),通过镍离子金属螯合层析纯化方法进行二次纯化得到融合蛋白,通过凝胶成像扫描方法检测其纯度,将融合蛋白进行透析复性,Bradford法检测复性后的蛋白浓度,WESTERNBLOT检测纯化及复性后的目的蛋白。
3淋巴细胞趋化实验和细胞锚定实验
将复性后的IP-10-SA融合蛋白调整成不同浓度(1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml,10000ng/ml),用PBS作为阴性对照,体外检测是否对单核细胞具有趋化活性,并应用流式细胞仪检测IP-10-SA对已生物素化的膀胱癌细胞MB49的锚定率,初步评价融合蛋白IP-10-SA的体外生物学活性。
结果:
1诱导表达IP-10-SA融合蛋白
将质粒pET24a-IP-10-SA转化入大肠杆菌中,涂布在带有氯霉素抗性和卡那霉素抗性的平板中,经37℃,18h孵育后长出单克隆菌落,并在菌落活化时间为5h,37℃,250rpm,0.1mMIPTG条件下诱导表达。经SDS-PAGE鉴定目的蛋白以包涵体形式表达,大小约28KD,经凝胶扫描仪分析目的蛋白约占菌体总蛋白的25%。
2包涵体洗涤,纯化,复性
洗后的包涵体用8M尿素溶解后经镍柱亲和层析纯化后的目的条带经SDSPAGE鉴定,条带经凝胶扫描仪分析纯度达95%,纯化后的目的条带峰值最高浓度为750μg/ml,梯度尿素复性后Bradford法检测蛋白浓度达210μg/ml,WESTERNBLOT检测发现复性后的融合蛋白以多聚体状态存在。
3细胞趋化实验和细胞锚定实验
细胞趋化实验表明IP-10-SA融合蛋白具有趋化人外周血单核细胞的活性且存在剂量依赖性,流式细胞仪检测IP-10-SA融合蛋白与生物素化的小鼠膀胱癌MB49细胞的锚定修饰效率为99.1%。
结论:
本研究成功的将pET24a-IP-10-SA质粒导入大肠杆菌中进行表达,通过包涵体洗涤及镍柱亲和层析纯化后得到高浓度和高纯度的融合蛋白,并在体外单核细胞趋化实验及细胞锚定实验中证实了IP-10-SA双功能融合蛋白在体外具有双重活性,为进一步进开展体内动物实验以及大规模制备IP-10-SA肿瘤细胞疫苗奠定了基础。