背景胸腺肽α1(Thymosin alpha-1, Tα1)是20世纪70年代末从胸腺素第5组分中分离纯化的含28个氨基酸的生物活性肽,具有多种生物学功能：(1)有证据表明Tα1能够促进T细胞的成熟与分化。Tα1能促进骨髓干细胞分化成CD4+/CD8+T细胞,调节外周血中的CD3/CD4+/CD8+细胞的平衡,刺激NK细胞和CTL细胞的分化从而消灭被病毒感染的靶细胞；Tα1能够通过增加IL-2来减少IL-4和IL-10等Th2细胞因子的分泌以及上调细胞因子受体,如高亲和力的IL-2受体等而发挥免疫调节功能。(2)在体内和体外试验中显示Tα1对多种肿瘤具有抑制作用。Tα1可抑制肿瘤细胞生长,减少癌细胞的浸润,并可提高其他抗癌药物的疗效。(3)Tα1可减少氧化损伤。Tα1可增加肝脏中超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活性,减少氧自由基对肝的损伤；此外,Tα1还能够通过减少丙二醛,增加谷胱甘肽过氧化物酶的水平,提高超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活性而改善胰腺功能。(4)Tα1有减轻癌症患者化疗药物造成的神经中毒症状、促进血管再生和伤口愈合等作用。目前,胸腺肽α1在临床上已被大量应用于乙肝、丙肝、获得性免疫缺陷综合综(AIDS)、严重急性呼吸综合征(SARS)脓毒症、肠道感染和肝硬化等疾病。但目前临床上人工合成的胸腺肽α1主要的给药方式仍为皮下或肌肉注射,容易产生过敏、感染等副作用；虽然从小牛胸腺中分离出的口服Tα1胶囊已经面市,通过基因工程技术也可获得具有生物活性的Tα1,但纯度低、产量少、成本高使这些来源的Tα1难以满足临床需求。双歧杆菌是人及其他动物肠道内的革兰氏阳性厌氧菌,属正常菌群,具有调节肠道菌群,提高免疫力,抗感染,抗肿瘤,提供营养物质等功能。近年来,出现了以转化双歧杆菌为载体表达目的多肽的新的给药方式。南方医科大学曾位森副教授曾以双歧杆菌为载体将胃泌素调节激素(oxyntomodulin)、白介素10(interleukin10)和人干扰素-α2b (interferon-α2b)分别用于小鼠肥胖、溃疡性结肠炎和病毒性心肌炎的治疗,并取得了良好的效果。本实验通过构建含人Tα1基因的双歧杆菌并检测CTL、Th1的含量,评估表达Tα1的双歧杆菌对小鼠细胞免疫功能的影响,探索Tα1的给药新途径。目的构建含Tα1基因的大肠-双歧杆菌表达载体,并以此载体转化双歧杆菌,观察目的多肽Tα1在双歧杆菌的表达及其对小鼠CTL和Th1介导的细胞免疫的影响,探索Tα1新的给药途径。方法。在pBBADs-GFP的BpiⅠ和XbaⅠ两个酶切位点插入合成的人Tα1基因,替换GFP基因,从而获得表达人Tα1的大肠杆菌-双歧杆菌穿梭表达质粒载体pBBADs-Tα1和不含Tα1的空载体pBBADs-0.用电穿孔的方法将表达载体pBBADs-Tα1和pBBADs-0分别转入双歧杆菌(NCC2705),经氨苄青霉素的筛选,得到分别含pBBADs-Tα1的双歧杆菌(BL-Tα1)和含pBBADs-0的双歧杆菌(BL-0)。做革兰氏染色,镜下观察转化后的双杆菌形态,并提取转化后形态正常双歧杆菌的基因组,以基因组为模板,PCR扩增16s rDNA片断做菌种鉴定,提取转化双歧杆菌的质粒进行测序鉴定。鉴定好的双歧杆菌在MRS液体培养基中培养至OD695nm达到0.8,用0.2%的L-阿拉伯糖诱导Tal的表达,分别于诱导后的0、12、24、36小时收集细菌菌体和培养上清,分别保存在-70℃备用。用ELISA和Western blot方法检测细菌菌体和细菌培养上清中Tal的表达。取6周左右、18-20g的雄性BALB/c小鼠,随机分成空白对照组(NS)、阴性对照组(BL-0)和实验组(BL-Tα1),每组8只。NS组小鼠给予0.9%生理盐水0.1ml灌胃,BL-0组小鼠给予阿拉伯糖诱导的BL-00.1ml(浓度为6×109/ml)灌胃,Tα1组小鼠给予阿拉伯糖诱导的BL-Tα10.1ml(浓度为6×109/ml)灌胃,所有组均为两天给药一次,自由进水与进食。两周后处死动物。收集小鼠肠内容物、外周血、胸腺、脾脏,分离胸腺和脾脏中的淋巴细胞。ELISA检测肠内容物、外周血中的Ta1的浓度,流式细胞术检测外周血中细胞因子(IFN-γ,IL-12,TNF-α,IL-4)的浓度和外周血、胸腺、脾脏中的CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+CD8+细胞的含量。取6周左右的雄性BALB/c小鼠24只,随机分为空白对照组(NS)、阴性对照组(BL-0)和实验组(BL-Tα1),每组8只,Tα1组小鼠给予阿拉伯糖诱导的BL-Tα10.1ml(浓度为6×109/ml)灌胃,用0.1ml0.9%生理盐水和阿拉伯糖诱导的BL-0(浓度为6×109/ml)灌胃,分别作为空白对照和阴性对照,所有组均为两天给药一次,自由进水与进食。三个月后处死动物。解剖小鼠,观察其胸腺,脾脏和外周淋巴结的发育和增生,并对淋巴结作组织学鉴定。实验结果用Mean±SD表示。实验数据使用SPSS13.0处理,多个样本均数的比较：方差齐者采用单因素方差分析,方差不齐采用Welch法分析；任意两组的比较：方差齐者用Bonferroni法,方差不齐的数据采用Dunnett’T3检验。P值小于0.05为有统计学意义。结果成功构建了含Tα1基因的大肠-双歧穿梭表达载体pBBADs-Tα1和不含Tα1基因的空白载体pBBADs-0。革兰氏染色镜下观察显示质粒pBBADs-Tα1和pBBADs转化的双歧杆菌形态结构无明显变化。16s rDNA和质粒测序结果成功的对转化双歧杆菌和其包含的质粒进行了鉴定。ELISA和Western blot检测结果显示经诱导后,在pBBADs-Tα1转化的双歧杆菌菌体和细菌培养上清中均有Tα1表达,说明此转化双歧杆菌合成的Tα1能够分泌到细胞外,是一种分泌性表达。此外还发现,培养上清中Tal浓度在诱导后24h达到最大值,pBBADs-0转化的双歧杆菌、未转化的双歧杆菌和pBBADs-Tα1转化而未诱导表达的双歧杆菌均无Tα1表达。灌胃小鼠两周的结果显示：(1)BL-Tα1组、BL-0组和NS组小鼠的肠内容物中Tα1浓度(pg/m1)分别为46.45±3.50、13.64±2.92、15.13±4±2.60,BL-Tal组明显高于BL-0组和NS组(均为P<0.001),BL-0组和NS组无显著性差异(P=0.997)；(2)BL-Tα1组、BL-0组和NS组小鼠的外周血中Tααl浓度(pg/m1)分别为15.61±1.65、14.14±4±1.72、15.07±2.17。BL-Tα1组与BL-0和NS组相比,无明显差异(P=0.388,P=1.000),BL-0与NS组相比,也无明显差异(P=0.992)；(3)BL-Tα1组小鼠外周血中IFN-γ、IL-12、TNF-α、IL-4的浓度(pg/m1)分别为47.32±±±3.96、65.86±3.71、9.57±1.42、13.76±2.85,BL-0组小鼠外周血中IFN-γ、IL-12、TNF-α、IL-4的浓度(pg/m1)分别为36.77±4.43、54.79±5.73、9.37±2.07、14.08±2.32,NS组小鼠外周血中IFN-γ、IL-12、TNF-α、IL-4的浓度(pg/m1)分别为31.26±4.68、50.91±5.16、9.08±1.74、15.00±3.31。与BL-0组和NS组相比,BL-Ta1组IFN-γ明显升高(P=0.001,P<0.001),IL-12明显升高(P=0.002,P<0.001)；与NS组相比,BL-0组IFN-γ和IL-12浓度无明显变化(P=0.089,P=0.475),三组之间,TNF-α和IL-4浓度均无明显变化(均为P=1.000)；(4)BL-Tal组小鼠中,CD3+CD4+在外周血、脾脏、胸腺中的比例(%)分别为59.66±3.05、22.05±2.26、16.08±1.57, CD3+CD8+在外周血、脾脏、胸腺中的比例(%)分别为6.403：0.72、6.8±0.62、7.12±0.79,CD4+CD8+在外周血、脾脏、胸腺中的比例(%)分别为0.21±0.06、3.49±0.64、10.08±1.37；BL-0组小鼠中,CD3+CD4-在外周血、脾脏、胸腺中的比例(%)分别为47.64±2.49、13.83±1.04、12.46±1.68,CD3+CD8+在外周血、脾脏、胸腺中的比例(%)分别为3.09±0.60、0.60±0.14、4.08±0.65, CD4+CD8+在外周血、脾脏、胸腺中的比例(%)分别为0.21±0.08、0.85±0.14、6.08±1.07；NS组小鼠中,CD3+CD4-在外周血、脾脏、胸腺中的比例(%)分别为44.45±2.65、10.54±1.19、12.08+1.61,CD3+CD8+在外周血、脾脏、胸腺中的比例(%)分别为2.84±4±0.56、0.45±0.11、3.71±0.61,CD4+CD8+在外周血、脾脏、胸腺中的比例(%)分别为0.24±0.07、0.44±0.07、6.03±0.96。与BL-0组和NS组外周血相比,BL-Ta1组外周血液中：CD3+CD4+明显升高(均为P<0.001),CD3+CD8+明显升高(均为P<0.001),CD4+CD8+无明显变化(均为P=1.000)；与BL-0组和NS组脾脏相比,BL-Ta1组脾脏中：CD3+CD4+明显升高(均为P<0.001),CD3+CD8+明显升高(均为P<0.001),CD4+CD8+明显升高(均为P<0.001)；与BL-0组和NS组胸腺相比,BL-Ta1组胸腺中：CD3+CD4+明显升高(P=0.001,P<0.001),CD3+CD8+明显升高(均为P<0.001),CD4+CD8+明显升高(均为P<0.001)。与NS组外周血相比,BL-0组外周血液中：CD3+CD4+升高不明显(P=0.090), CD3+CD8+和CD4+CD8+均无无显著性差异(均为P=1.000);与NS组脾脏相比,BL-0组脾脏中：CD3+CD4+明显升高(P<0.001),CD3+CD8+升高不明显(P=0.090),CD4+CD8+明显升高(P=0.000)；与NS组胸腺相比,BL-0组胸腺中： CD3+CD8+无明显升高(P=0.910), CD3+CD4+和CD4+CD8+亦无显著性差异(均为P=1.000)。灌胃三个月的动物实验结果为：BL-Tα1组中5只小鼠出现了外周淋巴结、脾脏和胸腺的明显增生,BL-0组和NS组中的小鼠无淋巴结、脾脏和胸腺增生。结论成功构建了含人Tα1基因的转化双歧杆菌；Tα1基因转化双歧杆菌能在体内、外分泌性表达Tα1；动物实验结果表明口服表达Tα1的双歧杆菌可明显促进脾脏和胸腺中T淋巴细胞的成熟和分化,增加小鼠外周血、脾脏和胸腺中CTL和Th1细胞的数量,提高外周血中Th1细胞因子的浓度,并促进小鼠外周淋巴结、脾脏和胸腺的生长发育。本研究中双歧杆菌作为载体,在肠道内表达分泌的Tα1可直接发挥免疫调节作用,具有使用方便,不需要纯化,生产成本低等优点,开辟了一条Tα1的生产和给药新途径。