番茄是世界上栽培最广泛的蔬菜作物之一,也是我国设施栽培中重要的蔬菜作物。随着我国近年来设施生产规模的不断扩大,番茄作为深受广大消费者青睐的蔬菜作物,栽培面积也在不断增加。要保障番茄的产量和品质,高效的授粉受精是番茄良好坐果与发育的关键。大量研究表明,植物的雄性生殖能力对作物育种、杂交制种以及基因漂移的调控等具有重要意义,因此花药和花粉的良好发育以及对非生物胁迫的耐受性对保证番茄的生产至关重要。油菜素内酯(Brassinosteroids,BRs)是一种重要的植物激素,在花粉中含量较高。虽然BR对植物生长发育的影响以及HSFs对植物响应逆境胁迫的调控已有研究报道,但它们对番茄花粉发育及逆境响应的调控机制仍存在诸多疑问。本文以蔬菜模式作物番茄(SolanumlycopersicumL)为研究对象,以细胞学、遗传学、分子生物学、生物化学为技术手段,研究了 BR对番茄花粉发育的影响;阐明了 BR介导的ROS对花粉发育过程中绒毡层降解的调控机制;研究了热激转录因子HsfA1a在番茄花粉高温抗性中的作用。所得主要结果如下:1.明确了 BR合成和信号转导提高番茄花粉生殖能力和种子产量。在BR合成基因DWF突变体 d^im 和BR信号转导下游的转录因子BZR1突变体bzr1-1中,花粉畸形率增加,花粉活力和萌发力减弱,平均每个果实中的种子数相较于野生型也减少,而相应的过表达材料DWF:OE2和BZR1:OE2中结果则与之相反。这些不同BR水平的材料自交和杂交表现出与相应材料的花粉生殖能力一致的结果,相比于野生型,BR突变体d^im和bzr1-1的花粉在自交或杂交柱头上萌发力较弱,且所得果实的种子数较少,反之BR过表达材料DWF:OE2和BZR1:OE2在柱头上的花粉萌发力则较强,果实结籽率也较高。上述结果表明,内源BR水平和BZR1介导的BR信号转导通过提高花粉质量促进番茄果实结籽。2.发现了 ROS参与BRs对绒毡层PCD发生和降解的促进作用。组织化学染色分析发现DWF或BZR1的缺失会导致绒毡层细胞降解延迟,而DWF或BZR1过表达则会使绒毡层的降解适当提前发生。通过TUNEL检测我们发现,这些表型与绒毡层细胞的PCD发生时间的改变相关。qRT-PCR检测拟南芥调控绒毡层和花粉发育的遗传网络中的8个番茄同源基因的转录水平发现,它们在突变体d^im和bzr1-1中表达下调,但在DWF和BZR1过表达材料中则显著上调。H2DCF-DA和NBT染色结果表明,在花粉发育过程中,绒毡层中的活性氧(ROS)水平在突变体d^im和bzr1-1中较低,但在DWF和BZR1过表达材料中则较高。qRT-PCR分析编码NADPH氧化酶的基因发现,RBOH1(RESPIRATORY BURST OXIDASE HOMOLOG 1)在雄蕊和根中特异表达。与野生型相比,RBOH1的转录水平在d^im和bzr1-1村料的雄蕊发育过程中下调,相反,在DWF和BZR1过表达材料的雄蕊发育过程中上调。上述结果表明,在番茄花粉发育过程中BR通过诱导ROS促进绒毡层细胞的PCD发生和降解。3.阐明了 BRs通过激活RBOHI基因表达诱导ROS产生促进绒毡层降解。酵母单杂交和ChIP-qPCR实验证明了 BZR1通过与RBOHI启动子的结合调控RBOHI的基因表达。为了进一步确认RBOHI在番茄花粉发育中的重要作用,我们构建了RBOH1的基因沉默材料,并以RBOH1i-RNAi番茄为实验材料开展研究。实验结果表明,由RBOH1产生的ROS可诱导番茄绒毡层细胞的PCD和降解,RBOH1转录水平的下调导致绒毡层中的ROS积累显著减少。当DWF和BZR1过表达材料中RBOH1基因表达受到抑制时,花粉活力和萌发力的增强均受到了抑制,同样,果实中种子的产量相比野生型也有所下降。上述结果表明,BRs通过直接调控RBOH1基因的转录诱导ROS产生,促进番茄花粉发育过程中绒毡层细胞的降解。4.HsfA1a通过诱导HSPs蛋白积累和自噬基因的表达提高番茄花粉高温抗性。对高温胁迫下花粉生殖能力的检测发现,HsfA1a过表达提高花粉的高温抗性,而HsfA1a突变则导致花粉的高温抗性减弱。高温胁迫的HsfA1a过表达番茄花药中HsfA2,HsfA3,HSP70和HSP90的基因表达显著上调,而HsfA1a敲除则抑制了花药中HsfA2,HsfA3,HSP70和HSP90基因的表达。此外,HsfA1a过表达促进了高温胁迫后花药中HSP70和HSP90蛋白的积累,而HSP70和HSP90的蛋白积累在HsfA1a敲除花药中却受到了抑制。进一步分析发现,高温胁迫后花药中ATG18f,ATG18g和ATG18h的基因表达在HsfA1a过表达植株中显著上调,在HsfA1a敲除植株中上调受到抑制。这些结果表明,HsfA1a可能通过对HSPs的诱导和自噬的调控增强了番茄植株花粉的高温抗性。